于 游 張才全 (重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胃腸外科,重慶 400016)

大腸癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤,無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的大腸癌5年生存率一般在70% ～80%,而有轉(zhuǎn)移者僅為 30%〔1〕。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響大腸癌預(yù)后的最主要因素之一,也是決定腫瘤分期和制定個(gè)體化療方案的主要參考指標(biāo)。因此,確定大腸癌有無(wú)轉(zhuǎn)移對(duì)判斷患者預(yù)后及指導(dǎo)治療至關(guān)重要。本文70例大腸癌患者的1120枚淋巴結(jié)進(jìn)行常規(guī)病理HE染色和CK20(CK20)及CEA免疫組織化(IHC)檢測(cè),并對(duì)兩種方法淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移結(jié)果進(jìn)行比較,目的在于探討大腸癌患者淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移對(duì)結(jié)直腸癌分期的影響,為大腸癌分期和制定個(gè)體化療方案作出評(píng)價(jià)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2003年10月至2009年10月在我院住院行開(kāi)腹切除手術(shù)的大腸癌患者70例,術(shù)前檢查無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,術(shù)前未進(jìn)行過(guò)化放療。其中男43例,女27例,年齡 32～78歲,平均年齡 55.1歲。部位:升結(jié)腸癌15例,橫結(jié)腸癌 6例,降結(jié)腸癌12例,乙狀結(jié)腸癌 12例,直腸上段癌15例,直腸下段10例。病理分型:高分化腺癌23例,中分化腺癌29例,低分化腺癌18例。TNM分期(1978年美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)(AJC)制定的結(jié)直腸癌國(guó)際 TNM標(biāo)準(zhǔn)):Ⅰ期4例,Ⅱ期29例,Ⅲ期37例。

1.2 試劑 CK20鼠抗人、CEA鼠抗人、即用型抗原修復(fù)液及SP試劑盒均購(gòu)自福州邁新生物制品公司。

1.3 標(biāo)本 70例結(jié)直腸癌標(biāo)本,共檢獲大腸腸旁、腸壁、腸系膜淋巴結(jié)共1 120枚,平均每例(16.5±0.4)枚。每枚新鮮淋巴結(jié)標(biāo)本,統(tǒng)一編號(hào),用甲醛溶液固定,將各蠟塊連續(xù)切片4張,1張行 HE染色,另3張行免疫組化SP法染色。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法 石蠟包埋后切片厚度4 μ m,經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水后,檸檬酸緩沖液微波法修復(fù)抗原;3%過(guò)氧化氫阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性;加入抗體,4℃過(guò)夜;DAB顯色,顯微鏡下觀(guān)察3～10 min,陽(yáng)性染色為棕色或黃色;蒸餾水沖洗,蘇木素復(fù)染,0.1%鹽酸分化,PBS返藍(lán);切片經(jīng)梯度酒精脫水干燥,中性樹(shù)膠封固;光鏡下觀(guān)察結(jié)果。每次染色均以 PBS代替一抗作陰性對(duì)照,直腸癌組織作為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果判斷以胞質(zhì)黃染或棕色為陽(yáng)性。CK20、CEA定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi),陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色,邊緣處顯著。陰性者無(wú)著色,淋巴結(jié)中淋巴細(xì)胞不著色。淋巴結(jié)中發(fā)現(xiàn)CK20、CEA著色細(xì)胞,經(jīng)高倍鏡下確認(rèn)有典型的癌細(xì)胞形態(tài),診斷為存在微轉(zhuǎn)移。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用四格表 χ2檢驗(yàn),用 SPSS13.0軟件完成統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié) 果

2.1 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及微轉(zhuǎn)移檢出率 用HE染色法淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移檢出率26.9%(301/1 120),CK20免疫組化淋巴轉(zhuǎn)移檢測(cè)率為36.1%(404/1 120),CEA免疫組化轉(zhuǎn)移檢測(cè)率為34.7%(389/1 120),兩者聯(lián)合檢測(cè)率為38.5%(431/1 120)。HE染色法與CK20及CEA免疫組化比較均有顯著性差異(P＜0.05),HE染色法與兩者聯(lián)合檢測(cè)率比較有顯著性差異(P＜0.05),CK20與CEA免疫組化檢測(cè)率比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。CK20檢測(cè)出有微轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)103枚,占9.2%(103/1 120),CEA檢測(cè)出有微轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)88枚,占7.9%(88/1 120)。CK20聯(lián)合CEA檢測(cè)出130枚淋巴結(jié)檢出有微轉(zhuǎn)移,占11.6%(130/1 120)。CK20、CEA及二者聯(lián)合檢測(cè)三組之間淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移率比較顯著性差異(P＞0.05)。微轉(zhuǎn)移表現(xiàn)為單個(gè)散在或2～3個(gè)及數(shù)個(gè)聚集小團(tuán)狀的癌細(xì)胞位于淋巴竇內(nèi),以邊緣竇為主,見(jiàn)圖 1,圖2。

圖1 CK20陽(yáng)性淋巴結(jié)(SP,×200)

圖2 CEA陽(yáng)性淋巴結(jié)(SP,×200)

2.2 淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移對(duì)病理分期的影響 在70例患者檢測(cè)出了有24例患者存在微轉(zhuǎn)移,占34.3%(24/70)。13例 TNM分期提高,其中Ⅰ期Ⅲ期2例,Ⅱ期Ⅲ期11例。HE染色重新分期率為18.6%(13/70)。

2.3 淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移與臨床病理特征關(guān)系 微轉(zhuǎn)移與癌腫浸潤(rùn)的深度有關(guān),腫瘤浸潤(rùn)愈深,微轉(zhuǎn)移愈易發(fā)生(P＜0.05)。微轉(zhuǎn)移還與組織類(lèi)型有密切關(guān)系,分化程度低者,微轉(zhuǎn)移陽(yáng)性率高(P＜0.05)。但微轉(zhuǎn)移與性別、年齡、腫瘤的部位、大小無(wú)關(guān)(P ＞0.05),見(jiàn)表1。

表1 結(jié)直腸癌淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移與臨床病理特征關(guān)系〔n(%)〕

3 討 論

結(jié)直腸癌患者,其局部原發(fā)灶采用手術(shù)為主的治療方法基本可以控制。但根治術(shù)后,其復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率高達(dá)30%～50%左右,特別是無(wú)“淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移”的Ⅰ期和Ⅱ期患者,5年內(nèi)死于局部復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的近30%〔2〕。分析其原因可能是因?yàn)榱馨徒Y(jié)、血道、骨髓中存在的微小轉(zhuǎn)移灶,用傳統(tǒng)的病理檢查方法很難檢出,而導(dǎo)致臨床無(wú)法及時(shí)和正確治療〔3〕。傳統(tǒng)上對(duì)淋巴結(jié)的病理學(xué)檢查是通過(guò)對(duì)其具有代表性的一個(gè)切面經(jīng)HE染色作普通光鏡檢查,這種常規(guī)方法不能查累及淋巴結(jié)的大部分組織,故有可能忽略淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的存在。由于這些微轉(zhuǎn)移有發(fā)展成致命的顯性轉(zhuǎn)移的可能,因此微轉(zhuǎn)移的檢測(cè)日益為人們所重視。近年來(lái),隨著組織化學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,利用免疫組化法可以發(fā)現(xiàn)常規(guī)HE染色所不能發(fā)現(xiàn)的單個(gè)癌細(xì)胞。Palma等〔4〕運(yùn)用該方法分析了38例 Dukes B期結(jié)直腸癌患者枚淋巴結(jié),檢查發(fā)現(xiàn)7枚淋巴結(jié)存在微轉(zhuǎn)移灶。吳澤宇等〔5〕應(yīng)用PCR技術(shù)對(duì)30例胃癌患者共850枚淋巴結(jié)檢測(cè)微轉(zhuǎn)移,結(jié)果有77枚淋巴結(jié)檢出有微轉(zhuǎn)移,7例患者的腫瘤TNM分期提高,HE染色重新分期率為23.3%(7/30)。但關(guān)于淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移檢測(cè)對(duì)結(jié)直腸癌臨床病理分期的影響尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究中,在70例結(jié)直癌病人1 120枚淋巴結(jié)中有24例患者共130枚淋巴結(jié)檢測(cè)出了微轉(zhuǎn)移,13例患者TNM分期提高,HE染色重新分期達(dá)18.6%(13/70)。故免疫組化的檢測(cè)可以顯著提高淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的檢出率,有助于更準(zhǔn)確地進(jìn)行結(jié)直腸癌的臨床病理分期。為大腸癌合理制定手術(shù)方案、指導(dǎo)手術(shù)清掃淋巴結(jié)及后續(xù)治療提供科學(xué)保證,減少結(jié)直腸癌術(shù)后轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)、提高結(jié)直腸癌以手術(shù)為主的綜合治療的療效。

由于腫瘤細(xì)胞具有異質(zhì)性,腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)水平會(huì)有很大的差異,單用一種標(biāo)志物只能檢測(cè)出高表達(dá)該基因的癌細(xì)胞,而對(duì)于低水平表達(dá)該基因的癌細(xì)胞就可能漏檢,所以多標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)微轉(zhuǎn)移已成為目前新的研究熱點(diǎn)〔6,7〕,許多學(xué)者也在不斷在探索聯(lián)合檢測(cè)兩種或兩種以上腫瘤標(biāo)志物的方法,目前研究比較多的是 CK、CEA、nm23-H(1)、MMP(9)及 TIMP(2)〔8〕。CK系列被認(rèn)為是檢測(cè)循環(huán)癌細(xì)胞的敏感標(biāo)記物。CEA是公認(rèn)的檢測(cè)循環(huán)癌細(xì)胞的敏感標(biāo)記物。筆者認(rèn)為,多標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)不僅有助于準(zhǔn)確腫瘤分期,可有效避免單一指標(biāo)造成的遺漏,有助于微轉(zhuǎn)移的診斷。但在本實(shí)驗(yàn)中CK20、CEA聯(lián)合檢測(cè)并未顯著提高微轉(zhuǎn)移檢測(cè)率,并不能否定標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)微轉(zhuǎn)移的發(fā)展趨勢(shì),可能與本實(shí)驗(yàn)選擇檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物組合不當(dāng)有關(guān),應(yīng)摸索更合理的組合,進(jìn)一步研究。

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