許呂宏， 方建培， 翁文駿， 徐宏貴

(中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院兒科，廣東 廣州 510120)

某些血液系統(tǒng)疾病如重型β－地中海貧血、再生障礙性貧血等均長期依賴輸血，造血干細胞移植是目前臨床上根治此類疾病的主要途徑［1］。臨床研究發(fā)現(xiàn)，在實體器官移植或造血干細胞移植前不少患者由于多次接受同種異基因輸血而致敏，高敏患者發(fā)生移植排斥的風險明顯增加［2］。然而造血干細胞移植與實體器官移植亦有所不同，輸注的造血干細胞循環(huán)于血液系統(tǒng)中，與致敏受者體內的免疫細胞及抗體接觸的機會更多而更易被損傷。研究發(fā)現(xiàn)輸血致敏的主要因素之一是血液含異基因白細胞，本課題組既往通過異基因脾細胞輸注方法建立了致敏動物模型［3］。本實驗擬探討異基因骨髓細胞在致敏和非致敏受者的歸巢與植入情況，為開展促進異基因造血干/祖細胞在致敏受者植入的策略研究提供實驗基礎。

材料和方法

1 動物及主要試劑

無特定病原體(SPF級)的C57BL/6(H－2Db)及BALB/c(H－2Dd)小鼠，均為雄性，6－8周，體重18－20 g，由中山大學實驗動物中心提供并飼養(yǎng)。羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯(5，6－carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester，CFSE)購自 Invitrogen，RPMI－1640培養(yǎng)基購自Invitrogen，F(xiàn)ITC 標記的大鼠抗小鼠H－2Db購自PharMingen。

2 致敏模型與骨髓移植

參照文獻［3］建立致敏動物模型，以C57BL/6小鼠脾細胞作為刺激源，BALB/c小鼠作為致敏受者。分離C57BL/6小鼠股骨及脛骨的骨髓，洗滌后用RPMI－1640培養(yǎng)基將細胞濃度調為5×1010/L，臺盼藍染色檢測細胞活力(＞99%)。部分骨髓細胞予熒光染料CFSE體外標記進行歸巢實驗。供者骨髓細胞于照射后4 h經(jīng)尾靜脈注射0.2 mL(1×107)到致敏BALB/c小鼠;取正常BABL/c小鼠作為非致敏模型。移植的致敏及非致敏受者各25只，同時取單純照射未移植的BABL/c小鼠10只作為空白對照組。

3 供者細胞標記及在受者體內歸巢示蹤

3.1 CFSE標記供者細胞 CFSE是一類透膜熒光染料，可用于標記細胞漿內的蛋白質［4］。分離供者C57BL/6或BALB/c小鼠骨髓細胞后，以紅細胞裂解液溶解紅細胞，應用PBS緩沖液將其濃度調整為(1－5)×1010/L，加入終濃度10 μmol/L 的 CFSE，置于37℃孵育10 min后，再與5倍體積含10%小牛血清的冷RPMI－1640完全培養(yǎng)液于－20℃孵育5 min以結束染色。應用PBS緩沖液洗滌細胞3次，RPMI－1640完全培養(yǎng)液調整細胞濃度，然后將細胞移植到受鼠體內進行示蹤檢查。染色后即時取少量細胞懸液，應用流式細胞儀檢測綠色熒光，激發(fā)光波長為488 nm。同時取部分染色后的細胞于37℃、體積分數(shù)5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，應用流式細胞儀及熒光顯微鏡觀察細胞熒光強度的變化。

3.2 供者細胞在移植受者各組織體內歸巢示蹤于移植后第2 h、12 h及48 h處死移植受者，制備致敏模型的脾臟、股骨細胞懸液及眼靜脈血，以Tris－NH4Cl溶液溶解紅細胞，流式細胞儀檢測綠色熒光的頻率(激發(fā)光波長為488 nm)。

4 供者細胞在受者體內植入分析

4.1 生存分析 移植后每日觀察致敏模型的生存狀況，記錄死亡時間，繪制生存曲線。

4.2 外周血象及骨髓細胞恢復 移植后每周從致敏模型尾靜脈采血20 μL，并用KX－21血細胞計數(shù)儀(Sysmex)檢測外周血白細胞、血紅蛋白及血小板等。同時每周分離致敏及非致敏受者的股骨，計數(shù)每根股骨中骨髓細胞的數(shù)量。

4.3 嵌合分析 移植后每周將受者骨髓細胞重懸于100 μL PBS緩沖液，加入1 μL FITC 標記的大鼠抗小鼠H－2Db抗體，混勻后置于4℃冰箱內避光孵育20 min。加入2 mL PBS緩沖液洗滌，1200 r/min離心5 min，棄上清后將細胞重懸于400 μL PBS緩沖液中，應用流式細胞儀檢測，同時分別取BALB/c及C57BL/6小鼠骨髓細胞作陰性對照及陽性對照。

5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差()表示，應用t檢驗或單因素方差分析;繪制Kaplan－Meier生存曲線并進行l(wèi)og－rank檢驗，檢驗水準設α=0.05。

結 果

1 熒光染料CFSE標記供者骨髓細胞

本實驗應用CFSE標記C57BL/6小鼠骨髓細胞，流式細胞儀檢測結果示標記率為(99.25±0.33)%，將細胞于體外培養(yǎng)48 h后再次檢測其標記率為(99.05±0.27)%，兩者差異無顯著(P＞0.05)。圖1顯示CFSE熒光染料標記骨髓細胞48 h后在倒置顯微鏡下和綠色熒光顯微鏡下的情況，細胞仍保持很高的綠色熒光強度，說明CFSE適用于體內動態(tài)示蹤研究。

Figure 1.The photos of bone marrow cells labeled with CFSE at 48 h(×100).A:cells under inverted microscope;B:cells under fluorescence microscope.圖1 CFSE標記骨髓細胞48 h在倒置顯微鏡和熒光顯微鏡下的情況

2 供者骨髓細胞在致敏模型的歸巢示蹤

移植后2 h、12 h、48 h取移植受者外周血、骨髓及脾臟制備單個細胞懸液，應用流式細胞儀檢測供者骨髓細胞(即CFSE+細胞)在各組織中的分布情況。結果如圖2所示，移植后第2 h，供者細胞在致敏受者體內股骨及脾臟的分布與非致敏受者相比，差異無顯著(P＞0.05)，但供者細胞在非致敏受者外周血的分布是非致敏組的3倍，差異顯著(P＜0.01);移植后第12 h，供者細胞在非致敏受者外周血、股骨及脾臟的分布是致敏組的7.20倍(P＜0.01)、1.05倍(P＜0.05)和2.97倍(P＜0.01)，差異均顯著;移植后第48 h，供者細胞在非致敏受者外周血、股骨及脾臟的分布是致敏組的33.00倍、3.04倍和27.32倍，差異顯著(均P＜0.01)。

3 致敏模型接受移植后的生存分析

如圖3顯示各組動物生存曲線，經(jīng)8 Gy［60Co］照射后的BALB/c小鼠，若單純照射而不予骨髓移植均在照射后10－16 d全部死亡，生存中位數(shù)為14 d。而照射后非致敏BALB/c小鼠經(jīng)尾靜脈移植1×107C57BL/6骨髓細胞后能全部存活。然而同樣經(jīng)8 Gy［60Co］照射預處理及尾靜脈移植1×107C57BL/6骨髓細胞，致敏組受者均于移植后2周左右全部死亡，生存中位數(shù)為13 d。Log－rank檢驗發(fā)現(xiàn)致敏組與單純照射移植組的差異無顯著(P＞0.05);但致敏組與非致敏組差異顯著(P＜0.01)。

4 移植后受者外周血和骨髓細胞恢復情況與嵌合分析

Figure 2.Homing trace of CFSE+donor bone marrow cells in different tissues of recipients at different time points after transplantation.A:2 h after transplantation;B:12h after transplantation;C:48 h after transplantation.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs non － sensitized recipients.圖2 移植后不同時點CFSE+供者骨髓細胞在受者體內不同組織的歸巢示蹤

Figure 3.Survival curves of recipients under irradiation with/without transplantation.圖3 單純照射及照射移植后受者的生存曲線

非致敏組受者予C57BL/6供者的骨髓細胞后其外周血象及股骨骨髓細胞計數(shù)隨時間推移而逐漸升高，而致敏組受者同樣予移植后其外周血象及股骨骨髓細胞計數(shù)隨時間推移均呈進行性下降，并出現(xiàn)明顯的貧血、出血等征象。如表1所示，移植后第7 d及第14 d，致敏組外周血白細胞及股骨骨髓細胞計數(shù)均明顯低于非致敏組(P＜0.05)。

本實驗應用正常BALB/c及C57BL/6小鼠股骨骨髓細胞作為陰性對照及陽性對照，檢測其H－2Db+細胞水平分別為(0.09±0.06)%和(99.78±0.20)%。骨髓移植后第7 d，取非致敏組與致敏組的骨髓細胞檢測H－2Db+細胞水平，結果分別為(48.07±4.70)%和(0.77±0.11)%，兩者差異顯著(P＜0.01)。移植后第14 d，H－2Db+細胞在非致敏組骨髓中百分比為(90.26±4.20)% ，說明供者細胞在非致敏受者體內呈穩(wěn)定植入狀態(tài);而致敏組由于骨髓細胞過少，未能進行H－2Db檢測。

表1 移植后受者白細胞、骨髓細胞恢復情況及嵌合分析Table 1.White blood cell(WBC)and bone marrow cells(BMCs)recovery and chimera analysis in recipients after transplantation(.n=5)

表1 移植后受者白細胞、骨髓細胞恢復情況及嵌合分析Table 1.White blood cell(WBC)and bone marrow cells(BMCs)recovery and chimera analysis in recipients after transplantation(.n=5)

＊＊P ＜0.01 vs non － sensitized recipients at the same time point.

BMCs(×106/Femur)Group WBC(×109/L)H－2Dbchimera(%)7 d 14 d 7 d 14 d 7 d 14 d Sensitized recipients 380 ±80＊＊ 320 ±80＊＊ 21 ±2＊＊ 6 ±2＊＊ 0.77 ±0.11＊＊Non－detection Non－sensitized recipients 1380±280 3240±300 396±27 596±32 48.07±4.70 90.26±4.20

討 論

本實驗應用熒光染料CFSE標記異基因供者骨髓細胞，結果顯示體外培養(yǎng)至48 h，細胞形態(tài)、熒光強度無明顯改變;同時應用流式細胞儀檢測，結果示標記陽性率達99%。進行體內示蹤的移植受者無異常表現(xiàn)，說明CFSE有較好的標記率和安全性。歸巢示蹤結果發(fā)現(xiàn)移植后第2 h，供者細胞在致敏受者外周血的分布有所減少;移植后第12 h及48 h，供者細胞在致敏受者外周血、股骨及脾臟的分布均較非致敏組明顯減少，說明供者細胞在這些組織中被破壞。我們實驗還發(fā)現(xiàn)，供者骨髓細胞在非致敏受者股骨中的分布于移植后第48 h的分布比第12 h分布增加了1倍，說明供者骨髓細胞在受者體內進行增殖分化。而在致敏組中，供者骨髓細胞于移植后第48 h在受者股骨的分布反而比第12 h的分布還少，說明致敏受者骨髓微環(huán)境可能還影響異基因骨髓細胞的增殖與分化。植入分析結果發(fā)現(xiàn)在非致敏組中，移植后受者能長期存活。移植后每周取外周血及骨髓細胞分析，結果發(fā)現(xiàn)其外周血象及骨髓細胞的數(shù)量均隨時間推移而進行性增加，嵌合體分析也進一步證實異基因骨髓在非致敏受者體內完全植入。而在致敏組中，致敏受者經(jīng)致死量照射后移植，2周左右全部死亡。血象及骨髓象均顯示隨時間推移而呈進行性下降。嵌合體分析結果也說明致敏受者排斥異基因供者骨髓細胞。

有關異基因骨髓細胞在致敏模型中被排斥的機制尚未明確，一般認為與受者體內記憶性免疫細胞及預存的抗體有關，其中抗體介導的移植排斥占主要地位?？贵w可能通過多種機制損傷造血干細胞，如抗體能與異基因骨髓細胞MHC分子結合，通過補體依賴或抗體依賴細胞介導的細胞毒性作用等途徑殺傷異基因骨髓細胞［5］。有研究表明此抗體的作用具有供者特異性，對無關供者或全相合骨髓細胞無殺傷作用［6］。另一方面，有研究認為致敏受者血清可影響造血祖細胞的增殖與分化。臨床實驗中，國外有學者將再障患者血清與骨髓細胞體外孵育培養(yǎng)，結果發(fā)現(xiàn)能明顯抑制造血細胞集落的形成［7］。最近我們課題組檢測15份重型β地中海貧血患兒血清，發(fā)現(xiàn)患兒血清中群體反應性抗體陽性標本有6例，陽性檢出率為40%，抗體強度在14% －75%;分離臍血CD34+細胞作為造血干/祖細胞，通過體外集落培養(yǎng)也發(fā)現(xiàn)血清群體反應性抗體能明顯抑制各種細胞集落形成［8，9］。

如何促進異基因骨髓細胞在致敏受者體內植入是目前研究的熱點。臨床治療高敏患者的措施有應用免疫抑制劑、單克隆抗體、免疫吸附、血漿置換等［10］。最近Xu等［11］在致敏動物模型的移植實驗中發(fā)現(xiàn)，增加預處理方案的強度能有效清除致敏免疫細胞，但不能防止致敏受者體內抗體介導的移植排斥。他們研究還發(fā)現(xiàn)，應用免疫球蛋白、抗CD19及抗B220單抗等均不能提高異基因骨髓細胞在致敏模型的植入。最近我們應用抗CD20單抗進行干預，發(fā)現(xiàn)能殺傷受者B細胞，降低致敏程度，但不能有效促進異基因造血干細胞在致敏受者的植入［12］。本實驗表明，異基因供者骨髓細胞在致敏受者體內脾臟及股骨等部位被清除，產(chǎn)生移植排斥。進一步探討致敏移植新策略將是未來的研究方向。

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