刁 然， 夏靖燕， 徐 峰△， 程玉生， 楊 燕， 王選錠

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬二院1呼吸科，2腫瘤放療科3感染管理科，浙江 杭州 310009)

大量研究證實(shí)不可分型流感嗜血桿菌(nontypeable Haemophilus influenzae，NTHi)是慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)急性加重最重要的病原體［1］。肺部感染 NTHi后，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞在氣道和肺實(shí)質(zhì)的聚集和炎癥細(xì)胞因子釋放，造成肺實(shí)質(zhì)損傷，甚至引起組織的破壞和重構(gòu)，從而促進(jìn)COPD的發(fā)生發(fā)展。因此研究NTHi所誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)過(guò)程對(duì)COPD的防治具有重要意義。目前有關(guān)NTHi分子發(fā)病機(jī)制研究多采用小鼠模型或體外細(xì)胞模型。建立人肺組織體外感染模型來(lái)研究細(xì)菌與肺組織互相作用的細(xì)胞和分子機(jī)制，將更能反映人體內(nèi)的真實(shí)情況。本研究將利用人NTHi肺組織體外急性感染模型(acute NTHi infection model，AHIM)來(lái)闡明 Toll樣受體2(Toll－like receptor 2，TLR2)－p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen－activated protein kinase，p38 MAPK)－ 核因子 κB(nuclear factor κB，NF － κB)信號(hào)通路在介導(dǎo)細(xì)菌炎癥反應(yīng)中的作用。

材料和方法

1 主要材料

NTHi為浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)中心的臨床分離株［1］;羥乙基哌嗪乙磺酸－谷氨酸介導(dǎo)的具有保護(hù)作用的有機(jī)溶劑(HEPES－glutamic acid buffer－ mediated organic solvent protection effect，HOPE)為德國(guó)Borstel研究中心贈(zèng)送;RPMI－1640為Gibco產(chǎn)品;TLR2單抗購(gòu)自Imgenex;GAPDH抗體購(gòu)自eBioscience;SB203580(p38 MAPK抑制劑)購(gòu)自Calbiochem;PDTC(NF－κB抑制劑)購(gòu)自Sigma;電泳遷移率檢測(cè)(EMSA)試劑盒購(gòu)自Pierce;酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒購(gòu)自R＆D。

2 體外肺組織NTHi感染模型

從5例因肺部孤立腫塊而接受胸科手術(shù)的成年患者的手術(shù)標(biāo)本中切取距腫塊5 cm外的正常肺組織。肺組織塊大小約1 cm×1 cm×1 cm。置于24孔組織培養(yǎng)板中培養(yǎng)。每塊肺組織加入800 μL的RPMI－1640培養(yǎng)液。肺組織塊與1010CFU/L的NTHi置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱共孵育4 h和24 h后，組織塊置于HOPE溶液中4℃固定48 h。

3 實(shí)時(shí)定量RT－PCR檢測(cè)TLR2 mRNA

檢測(cè)肺組織TLR2 mRNA的表達(dá)，取肺組織約50 mg，加入1 mL Trizol后置于組織勻漿器中碾成勻漿。勻漿移入無(wú)RNase的Eppendorff管。參照RNA抽提試劑盒說(shuō)明操作。取RNA 2 μg，加oligo dT、逆轉(zhuǎn)錄酶等逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR擴(kuò)增TLR2和18S rRNA mRNA。TLR2引物序列:正義鏈5'－CCATTCCCCAGCGCTTT－3';反義鏈5'－CCGCTGAGCCTCGTCCAT－3';18SrRNA引物序列:正義鏈5'－TCAAGAACGAAAGTCGGAGG－3';反義鏈5'－GGACATCTAAGGGCATCACA －3'［2］。計(jì)算 2 組標(biāo)本間TLR2基因表達(dá)的相對(duì)差異:AHIM組/Medium組=2－ ΔΔCp;ΔΔCp=(CpTLR2－AHIM－ Cp18SrRNA－AHIM)－(CpTLR2－Medium－Cp18S rRNA－Medium)。

4 Western blotting檢測(cè)AHIM中磷酸化p38 MAPK的表達(dá)

取30 μg組織蛋白，經(jīng)12%十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS－PAGE)電轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜，脫脂奶粉封閉。Ⅰ抗為小鼠抗人TLR2抗體(1∶1500)或兔抗人磷酸化p38 MAPK抗體(1∶1000)，Ⅱ抗為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶4000)或羊抗兔IgG(1∶4000)，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色。分別以GAPDH或p38 MAPK表達(dá)量作內(nèi)參照。

5 電泳遷移率檢測(cè)(EMSA)檢測(cè)NF－κB

嚴(yán)格按EMSA檢測(cè)試劑盒操作。取組織核蛋白5 μg上樣，NF－κB 的探針序列為:5'－AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC－3'，結(jié)合反應(yīng)檢測(cè)體系為:10 × binding buffer 2 μL，1 g/L poly(dI·dC)1 μL，50%glycerol 1 μL，NP －401 μL，100 mmol/L MgCl21 μL，biotin end － labeled target DNA 2 μL，ddH2O補(bǔ)足20 μL。非變性聚丙烯酰胺凝膠中100 V電泳80 min，100 V轉(zhuǎn)膜60 min，70℃固定1 h?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)生物素標(biāo)記DNA。

6 AHIM炎癥反應(yīng)的調(diào)控研究

肺組織(1 cm×1 cm×1 cm)預(yù)先與抗TLR單抗(anti－ TLR2∶5 mg/L)、MAPK 抑制劑(SB203580:20 μmol/L)或 NF － κB 抑制劑(PDTC:25 μmol/L)孵育2 h。然后加NTHi(1010CFU/L)刺激24 h，收集組織上清，置于－20℃，待測(cè)ELISA。

7 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)IL－8

采用雙抗夾心ELISA法測(cè)定，操作步驟見R＆D公司說(shuō)明。IL－8測(cè)定靈敏度為31.2 ng/L。

8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，行配對(duì)t檢驗(yàn)或單因素方差分析(One－way ANOVA)。

結(jié) 果

1 AHIM中TLR2的表達(dá)

肺組織感染NTHi 4 h和24 h后，TLR2 mRNA和蛋白表達(dá)都明顯上調(diào)，見圖1。

Figure 1.Enhanced expression of TLR2 mRNA(A)and protein(B)was found in lung tissues infected with NTHi 4 h and 24 h after stimulation..n=3－5.*P＜0.05 vs medium group;△P ＜0.05 vs 0 h.圖1 NTHi刺激4 h和24 h后，肺組織TLR2表達(dá)明顯增加

2 AHIM中磷酸化p38 MAPK蛋白的表達(dá)

Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，NTHi刺激肺組織4 h，AHIM中磷酸化p38 MAPK蛋白表達(dá)較刺激前明顯增強(qiáng)，見圖2。

Figure 2.Elevated level of phosphorylation of p38 MAPK was detected in lung tissues infected with NTHi 4 h after stimulation..n=3.*P＜0.05 vs 0 h.圖2 NTHi刺激4 h后AHIM中磷酸化p38 MAPK表達(dá)

3 NTHi刺激后AHIM 的NF－κB活性檢測(cè)

EMSA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，NTHi刺激4 h，AHIM中NF－κB的DNA結(jié)合能力較對(duì)照組明顯增強(qiáng)，見圖3。

4 AHIM上清中的炎癥因子測(cè)定

組織上清 IL－8檢測(cè)顯示，TLR2單抗、p38 MAPK和NF－κB抑制劑能顯著降低NTHi所誘導(dǎo)的肺組織炎癥反應(yīng)，見圖4。結(jié)果提示:NTHi通過(guò)TLR2－p38MAPK－NF－κB通路來(lái)誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。

Figure 3.NF－κB activation was detected by EMSA in lung tissues infected with NTHi 4 h after stimulation.Lane 1:control;Lane 2:NTHi stimulation.圖3 NTHi刺激4 h后EMSA法檢測(cè)AHIM中NF－κB的活性

Figure 4.Effects of anti－TLR2，p38 MAPK and NF － κB inhibitors on NTHi－induced IL－8 production in lung tissues..n=5.*P＜0.05 vs NTHi group.圖4 TLR2單抗、p38 MAPK和NF－κB抑制劑對(duì)NTHi誘導(dǎo)IL－8生成的影響

討 論

我們從因肺部孤立結(jié)節(jié)或腫塊而接受肺葉或全肺切除的手術(shù)標(biāo)本中切取腫塊遠(yuǎn)處的正常肺組織塊，體外與NTHi共孵育，建立AHIM。該模型可作為連接人體細(xì)胞和整體動(dòng)物模型的橋梁，為在組織水平研究肺部疾病的病理生理變化提供一個(gè)功能平臺(tái)。利用AHIM和HOPE技術(shù)便于開展肺部感染性疾病發(fā)生早期不同橫斷面的組織、分子病理學(xué)研究［3，4］。并且AHIM模型較小鼠模型和體外細(xì)胞模型更接近機(jī)體內(nèi)的真實(shí)情況。

近年來(lái)，利用小鼠基因敲除模型，TLR2受體被證實(shí)是NTHi的重要識(shí)別受體［1］。通過(guò)體外細(xì)胞感染實(shí)驗(yàn)，研究者也發(fā)現(xiàn):NTHi感染可激活上皮細(xì)胞多條信號(hào)通路，啟動(dòng)靶基因表達(dá)，參與NTHi發(fā)?。?］。既往研究中，NF－κB和p38 MAPK被證實(shí)為介導(dǎo)NTHi誘發(fā)免疫反應(yīng)的重要信號(hào)分子［1］。有研究表明:阻斷p38 MAPK通路并不影響NF－κB/RelA的核轉(zhuǎn)位和向IL－8基因啟動(dòng)子的聚集，但降低了IL－8啟動(dòng)子處的p65/RelA的磷酸化水平，同時(shí)抑制了細(xì)菌誘導(dǎo)的RNA聚合酶Ⅱ向IL－8啟動(dòng)子的募集［6］。這些結(jié)果顯示:p38 MAPK可以通過(guò)調(diào)節(jié)NF－κB p65介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活化，從而影響炎癥因子表達(dá)。

利用AHIM模型，我們發(fā)現(xiàn)NTHi感染后，肺組織TLR2－p38 MAPK－NF－κB信號(hào)通路迅速被激活。用抗TLR2抗體或特異性MAPK和NF－κB分子阻斷劑可以顯著抑制NTHi所誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。我們的研究在組織水平闡明NTHi主要通過(guò)TLR－2－p38 MAPK－NF－κB信號(hào)通路來(lái)誘導(dǎo)肺組織分泌炎癥因子。同時(shí)我們的工作再次證實(shí)，HOPE固定技術(shù)對(duì)肺組織的核酸和蛋白有很好的保護(hù)作用［4］。

AHIM結(jié)合HOPE固定技術(shù)，為研究病原菌與機(jī)體組織的相互作用提供了很好的研究平臺(tái)。進(jìn)一步深入了解NTHi促炎癥反應(yīng)的細(xì)胞和分子機(jī)制，有助于新的分子靶向性藥物的研發(fā)。

［1］Xu F，Xu Z，Zhang R，et al.Nontypeable Haemophilus influenzae induces COX－2 and PGE2expression in lung epithelial cells via activation of p38 MAPK and NF－κB［J］.Respir Res，2008，9:16.

［2］Xu F，Droemann D，Rupp J，et al.Mo-dulation of the inflammatory response to Streptococcus pneumoniae in a model of acute human lung tissue infection［J］.Am J Respir Cell Mol Biol，2008，39(5):522 －529.

［3］Olert J，Wiedorn KH，Goldmann T，el al.HOPE fixation:a novel fixing method and paraffin－embedding technique for human soft tissues ［J］.Pathot Res Pracl，2001，197(12):823－826.

［4］夏靖燕，徐 峰，傅燕飚.介紹一種新的肺組織體外固定液［J］.中華病理學(xué)雜志，2008，37(11):787－788.

［5］Li JD.Exploitation of host epithelial signaling networks by respiratory bacterialpathogens ［J］. J Pharmacol Sci，2003，91(1):1－7.

［6］Schmeck B，Zahlten J，Moog K，et al.Streptococcus pneumonia－induced p38 MAPK－dependent phosphorylation of RelA at the interleukin－8 promotor［J］.J Biol Chem，2004，279(51):53241－53247.