張娜娜， 李茂蓮， 邊云飛， 高 奮， 楊志明， 楊慧宇， 肖傳實(shí)

(山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院心內(nèi)科，山西 太原 030001)

腎素－血管緊張素系統(tǒng)(renin－angiotensin system，RAS)是機(jī)體維持正常血壓、水電解質(zhì)平衡的重要系統(tǒng)。近年來(lái)，隨著越來(lái)越多生物活性血管緊張素肽以及與這些肽相互作用受體的發(fā)現(xiàn)，腎素血管緊張素系統(tǒng)越來(lái)越復(fù)雜。2002年Nguyen等［1］首次報(bào)道人腎素(原)受體［(pro)renin receptor，(P)RR］的存在，并且克隆了該受體。(P)RR在人體內(nèi)廣泛分布，免疫細(xì)胞化學(xué)研究表明，(P)RR主要分布在遠(yuǎn)端腎小管、腎小球系膜區(qū)、腎和冠脈血管的平滑肌細(xì)胞、新生大鼠的心肌細(xì)胞、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞及人的單核細(xì)胞。自從(P)RR被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，關(guān)于(P)RR在腎臟和心臟中的生理及病理作用越來(lái)越受到重視，特別是在糖尿病腎病和心肌梗死發(fā)病中的研究［2－4］。大量研究發(fā)現(xiàn)RAS參與了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病過(guò)程［5，6］，抑制 RAS對(duì)治療心血管疾病具有良好效果。而血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，Ang II)是RAS中的主要活性物質(zhì)，血管緊張素－(1－7)［angiotensin－(1－7)，Ang－(1－7)］是 AngⅠ和 AngⅡ轉(zhuǎn)化而成的7肽生物活性物質(zhì)，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)其在許多方面與AngⅡ有著相拮抗的作用。血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)是血管組成的主要細(xì)胞，在動(dòng)脈粥樣硬化形成、高血壓和血管再狹窄等疾病中起重要作用，故本研究將觀察AngⅡ和Ang－(1－7)對(duì)VSMCs(P)RR的調(diào)節(jié)，并進(jìn)一步探討其機(jī)制。

材料和方法

1 材料

細(xì)胞培養(yǎng)基 DMEM、胎牛血清購(gòu)自 Hyclone;A7r5細(xì)胞株購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù);胰蛋白酶、AngⅡ、Ang－(1－7)和renin為Sigma產(chǎn)品;RNA抽提試劑盒購(gòu)自Gibco;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自MBI;內(nèi)參照物GAPDH和(P)RR購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。SYBR Premix Ex TaqTMII購(gòu)自TaKaRa，(P)RR單克隆抗體購(gòu)自Sigma，辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的羊抗兔IgG購(gòu)自Cell Signaling Technology，其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 大鼠VSMCs的培養(yǎng)

A7r5細(xì)胞株用含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)瓶中置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)亞融合狀態(tài)時(shí)，以0.25% －EDTA胰蛋白酶消化、傳代。選擇生長(zhǎng)良好的第2－5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

3 實(shí)驗(yàn)分組

將生長(zhǎng)在6孔培養(yǎng)板上和50 mL培養(yǎng)瓶中無(wú)血清靜止培養(yǎng)6 h的VSMCs培養(yǎng)液，按以下分組加入不同干預(yù)因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。(1)對(duì)照組:不加干預(yù)因素;(2)不同濃度AngⅡ組:分別加入AngⅡ10、100、1000 nmol/L;(3)不同濃度Ang－(1－7)組:分別加入Ang－(1 －7)10、100、1000 nmol/L;(4)AngⅡ +losartan(AT1受體拮抗劑)組:losartan 10－6mol/L預(yù)處理30 min后，再加入AngⅡ 100 nmol/L;(5)AngⅡ+PD123319(AT2受體拮抗劑)組:先用PD12331910－5mol/L預(yù)處理30 min后，再用終濃度為100 nmol/L AngⅡ;(6)CGP42112A(AT2受體激動(dòng)劑)組:加入10－7mol/L CGP42112A。

4 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)(P)RR mRNA表達(dá)

收集培養(yǎng)的細(xì)胞，應(yīng)用RNA提取試劑盒提取RNA，并用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)，其后取5 μL RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA后，以GAPDH作為內(nèi)參照，采用SYBR Green法實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，反應(yīng)為20 μL體系，包含上、下游引物、DNA模板、SYBR Premix Ex TaqTMII和dH2O。大鼠(P)RR上游引物5'－CATAAGCATCTCGCCAAGG －3'，下游引物5'－ACCAGGGATGTGTCGAATGA －3'，產(chǎn)物片段224 bp。GAPDH上游引物 5'－TGAACG GGAAGCTCACTGG －3'，下游引物 5'－ TCCACCACCCTGTTGCTGTA－3'，產(chǎn)物片段307 bp。定量反應(yīng)條件:95℃10 min，然后95 ℃ 15 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。各組PCR均重復(fù)3次。mRNA的相對(duì)表達(dá)量用 2－ΔΔCt方法來(lái)表示，其中 ΔCt=Ct目標(biāo)mRNA－CtGAPDH，ΔΔCt= ΔCt處理－ ΔCt對(duì)照。

5 Western blotting檢測(cè)(P)RR蛋白的表達(dá)

收集培養(yǎng)的細(xì)胞，PBS洗滌2遍，收集細(xì)胞，加入1 mL細(xì)胞裂解緩沖液，4℃旋轉(zhuǎn)裂解30 min，12000 r/min離心15 min，收集上清。Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，取60 μg的總蛋白經(jīng)10%SDSPAGE膠電泳分離，常規(guī)方法轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5%脫脂奶粉TBS－T溶液37℃封閉3 h后，加入(P)RR單克隆抗體(1∶1000稀釋)4℃孵育過(guò)夜，用1×TBS溶液洗膜4×10 min。孵育Ⅱ抗，室溫(1∶10000稀釋)4 h，1 ×TBS溶液洗膜 4 ×10 min。辣根過(guò)氧化物酶HRP－ECL發(fā)光法檢測(cè)，用凝膠成像系統(tǒng)拍照，用Lab－Work軟件進(jìn)行灰度分析。各組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0 For Windows軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，各組均數(shù)進(jìn)行單因素方差分析，多重比較采用LSD法。

結(jié) 果

1 大鼠血管平滑肌細(xì)胞形態(tài)觀察

A7r5細(xì)胞株傳代后2－3 d細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)亞融合狀態(tài)，顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞呈梭形或長(zhǎng)梭形，成束的細(xì)胞平行排列，表現(xiàn)出“峰－谷”狀生長(zhǎng)，見(jiàn)圖1。

2 AngⅡ?qū)SMCs(P)RR mRNA表達(dá)的影響

與對(duì)照組比，不同濃度AngⅡ可以促進(jìn)VSMCs(P)RR mRNA表達(dá)，并且呈濃度依賴性(均 P＜0.05);加入CGP42112A可以促進(jìn)VSMCs(P)RR mRNA表達(dá)(P＜0.05)，加入PD123319可抑制(P)RR的VSMCs mRNA表達(dá)(P＜0.05)，加入losartan不能抑制VSMCs(P)RR mRNA表達(dá)(P＞0.05)，見(jiàn)圖2。

3 Ang－(1－7)對(duì)VSMCs(P)RR mRNA表達(dá)的影響

與對(duì)照組比，不同濃度 Ang－(1－7)可抑制(P)RR mRNA表達(dá)(均P＜0.05)，各濃度之間比較無(wú)顯著差異(均P＞0.05)，見(jiàn)圖3。

Figure 1.The morphological observation of rat VSMCs.The cells showed a“hill and valley”growth pattern.A:×100;B:×200.圖1 大鼠血管平滑肌細(xì)胞

Figure 2.Effect of AngⅡon the mRNA expression of(P)RR..n=6.＊＊P ＜0.01 vs control group;##P ＜0.01 vs AngⅡ group.圖2 AngⅡ處理各組細(xì)胞(P)RR mRNA的表達(dá)

Figure 3.Effects of Ang－(1－7)on the mRNA expression of(P)RR..n=6.＊＊P＜0.01 vs control group.圖3 Ang－(1－7)處理各組細(xì)胞(P)RR mRNA的表達(dá)

4 AngⅡ?qū)SMCs(P)RR蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)

與對(duì)照組比，不同濃度AngⅡ可以促進(jìn)VSMCs(P)RR蛋白的表達(dá)，并且呈濃度依賴性(P＜0.01);加入CGP42112A可以促進(jìn)VSMCs(P)RR蛋白的表達(dá)(P＜0.01)，加入 PD123319可抑制 VSMCs(P)RR蛋白的表達(dá)(P＜0.01)，加入losartan不能抑制VSMCs(P)RR蛋白的表達(dá)(P＞0.05)，見(jiàn)圖4。

5 Ang－(1－7)對(duì)VSMCs(P)RR蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)

與對(duì)照組比，不同濃度 Ang－(1－7)可抑制VSMCs(P)RR蛋白的表達(dá)(均P＜0.01)，各濃度之間比較無(wú)顯著差異(均P＞0.05)，見(jiàn)圖5。

Figure 4.Effect of AngⅡon the expression of(P)RR protein..n=6.＊＊P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs AngⅡgroup.圖4 AngⅡ處理各組細(xì)胞(P)RR受體蛋白的表達(dá)

Figure 5.Effect of Ang－(1－7)on the expression of(P)RR protein..n=6.＊＊P＜0.01 vs control group.圖5 Ang－(1－7)處理各組細(xì)胞(P)RR受體的免疫印記結(jié)果

討 論

RAS是機(jī)體維持正常血壓、水電解質(zhì)平衡的重要系統(tǒng)。近年來(lái)，(P)RR在心血管疾病中的作用越來(lái)越受到人們的關(guān)注。研究表明，腎素和腎素前體通過(guò)與(P)RR結(jié)合，可發(fā)揮不依賴于Ang II的生物學(xué)作用，使腎系膜細(xì)胞增殖［7］，平滑肌細(xì)胞增殖和遷移等［6］。

VSMCs異常增殖是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成、高血壓和血管成形術(shù)后再狹窄等血管增殖性疾病共同的細(xì)胞病理學(xué)基礎(chǔ)。在心血管系統(tǒng)中，VSMCs不僅是Ang II的一個(gè)重要來(lái)源，而且，也是Ang II調(diào)節(jié)血管功能的主要靶細(xì)胞。在生理或病理?xiàng)l件下，Ang II除直接作用于VSMCs，引發(fā)細(xì)胞收縮或增殖外，還可通過(guò)誘導(dǎo)VSMCs表達(dá)、釋放多種生物活性物質(zhì)，產(chǎn)生一系列繼發(fā)效應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比，AngⅡ可以促進(jìn)VSMCs(P)RR mRNA和蛋白的表達(dá)，并且呈濃度依賴性(均P＜0.05);加入AT2受體激動(dòng)劑CGP42112A可以促進(jìn)VSMCs(P)RR的mRNA和蛋白的表達(dá)，加入AT2受體拮抗劑PD123319可抑制(P)RR的 VSMCs mRNA和蛋白的表達(dá)(均 P＜0.01)，加入 AT1受體拮抗劑 losartan則不能抑制VSMCs(P)RR mRNA和蛋白的表達(dá)，故AngⅡ可能通過(guò)AT2受體上調(diào)(P)RR，從而促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖。

Ang－(1－7)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的RAS又一新成員，主要由血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(angiotensin converting enzyme 2，ACE2)分解 Ang Ⅱ所產(chǎn)生［7］。Ang －(1－7)在多種病理生理過(guò)程中拮抗AngⅡ，對(duì)于RAS過(guò)度激活所導(dǎo)致的病變，如高血壓、心力衰竭和動(dòng)脈粥樣硬化等［8－10］起保護(hù)作用。亦有研究發(fā)現(xiàn)，Ang－(1－7)可抑制內(nèi)膜損傷模型的中膜平滑肌細(xì)胞的增殖［11，12］，但其抑制 VSMCs增殖和遷移活性的分子機(jī)制至今未明。腎素和腎素前體通過(guò)與(P)RR結(jié)合，可促進(jìn)平滑肌細(xì)胞遷移。本文通過(guò)用不同濃度的Ang－(1－7)干預(yù)血管平滑肌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Ang－(1－7)可抑制(P)RR mRNA表達(dá)，各濃度之間比較無(wú)顯著差異，故Ang－(1－7)抑制平滑肌細(xì)胞增殖的作用可能部分是通過(guò)調(diào)節(jié)(P)RR實(shí)現(xiàn)的。

腎素(原)受體系統(tǒng)可產(chǎn)生不依賴于Ang II的生物學(xué)作用，使人們更加深入地認(rèn)識(shí)RAS，將會(huì)為心、血管及腎臟疾病治療提供新的思路。

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