劉小旭，劉夢(mèng)潔，代志軍※，王西京，康華峰

(1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院腫瘤科，西安710004;2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，西安710061)

胰腺癌的發(fā)病在世界范圍內(nèi)迅速增加，其惡性程度高、轉(zhuǎn)移早、治療困難、預(yù)后差，是腫瘤學(xué)界的一大難題。近年來(lái)，靶向治療因其特異性強(qiáng)、靶向抑制作用和不良反應(yīng)輕微，在腫瘤治療中占有重要地位。分子靶向藥物可通過(guò)阻斷腫瘤細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而控制細(xì)胞基因表達(dá)的改變，產(chǎn)生抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的效應(yīng)。磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)通路是與細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡關(guān)系最為密切的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一［1］。作為mTOR抑制劑，雷帕霉素(rapamycin，RPM)在腫瘤分子靶向治療中受到了越來(lái)越多的關(guān)注。本研究以體外培養(yǎng)的人胰腺癌PC-2細(xì)胞為對(duì)象，探討RPM對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料 胰腺癌PC-2細(xì)胞株由西安交通大學(xué)管海濤博士惠贈(zèng)。新生牛血清(Gibco，USA);RPMI1640 培養(yǎng)基(Gibco，USA);碘化丙啶 (propidiumiodide，PI)(Sigma，USA);四甲基偶氮唑鹽(Sigma，USA);熒光探針羅丹明123(Rhodamine 123)(Sigma，USA);RPM(Sigma，USA);其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。流式細(xì)胞儀(Becon Dickinson Facsalibur公司，USA)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和傳代PC-2細(xì)胞于37℃、5%CO2混合氣體和飽和濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，生長(zhǎng)培養(yǎng)基為RPMI 1640完全培養(yǎng)基，含10%熱滅活(56℃，30 min)的小牛血清、青霉素100 U/mL、鏈霉素100 U/mL，待細(xì)胞生長(zhǎng)呈單層鋪滿瓶底時(shí)，用0.25%的胰蛋白酶∶0.02%乙二胺四乙酸=1∶1的混合消化液消化傳代。細(xì)胞換液時(shí)間為2 d，傳代5 d。

1.3 細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC-2細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化、臺(tái)盼藍(lán)染色后在紅細(xì)胞計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)，確?；罴?xì)胞在97%以上。調(diào)整細(xì)胞濃度為每孔5×103個(gè)(每孔100 μL)，加到96孔培養(yǎng)板中。將培養(yǎng)板放入37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。另設(shè)對(duì)照組。待細(xì)胞貼壁后取出培養(yǎng)板，分別加入適量RPM，使終濃度分別為 10、20、30、40 和50 nmol/L，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔;同時(shí)設(shè)置未加RPM者為空白對(duì)照組和調(diào)零孔。培養(yǎng)板放回孵箱繼續(xù)培養(yǎng)6 h，取出培養(yǎng)板，每孔加入四甲基偶氮唑鹽5 μg/μL，培養(yǎng)板再放回孵箱孵育4 h。吸出上清液，加入200 μL二甲基亞砜。在平板搖床搖10 min，用酶標(biāo)儀測(cè)490 nm波長(zhǎng)處每孔的吸光度(A值)。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(IR%)=［(對(duì)照組 A值 －處理組 A值)/對(duì)照組 A值］×100%

1.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，常規(guī)消化，制成單細(xì)胞懸液。計(jì)數(shù)并均以105個(gè)/mL濃度接種于6個(gè)50 cm培養(yǎng)瓶中，分別加入適量RPM，使終濃度分別為10、20、30、40 和 50 nmol/L，常規(guī)培養(yǎng)48 h后，消化并收集細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液加入離心管中，800 r/min離心5 min，棄掉離心管中上清;以冰PBS緩沖液漂洗兩遍，沿管壁緩慢加入75%的4℃乙醇固定，4℃過(guò)夜;測(cè)試前用PBS液洗去乙醇，離心除去上清，每管加入100 μg/mL RNA酶1 mL，置于37℃孵箱中30 min;然后每管中加入125 μg/mL碘化丙啶1 mL標(biāo)記，低溫(2～8℃)避光靜置30 min，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.5 mTOR mRNA表達(dá)檢測(cè) PC-2細(xì)胞按1×106個(gè)/瓶接種于100 mL培養(yǎng)瓶中，孵育24 h待細(xì)胞貼壁后加 RPM。RPM 按 0、10、20、30、40 和 50 nmol/L濃度梯度分別處理12 h，收集細(xì)胞，用Trizol提取總RNA。取1 μg RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶在下列條件下合成cDNA:70℃ 5 min，42℃ 延伸 60 min，95℃ 酶滅活3 min，4℃終止反應(yīng)。然后用該cDNA作為模板進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)，PCR引物由 Invitrogen公司合成。mTOR引物序列:5'-CGCTGTCATCCCTTTATCG-3'(sense)和5'-ATGCTCAAACACCTCCACC-3'(anti-sense)，擴(kuò)增片段為218 bp，退火溫度為55℃(35個(gè)循環(huán))。內(nèi)對(duì)照β肌動(dòng)蛋白(β-actin)引物序列:5'-GTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3'(sense)，5'-TGCTGTCACCTTCACCGTTC-3'(anti-sense)，擴(kuò)增片段為136 bp，退火溫度為55℃(40個(gè)循環(huán))。擴(kuò)增條件如下:95℃預(yù)變性3 min，95℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，進(jìn)行相應(yīng)循環(huán)次數(shù)。PCR產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳，50 mL瓊脂糖中加溴乙錠2.0 μL凝膠成像系統(tǒng)作密度指數(shù)分析。β-actin擴(kuò)增產(chǎn)物為內(nèi)參照。mTOR mRNA相對(duì)表達(dá)量的判定:以各mTOR mRNA電泳條帶密度指數(shù)與相對(duì)的內(nèi)參照β-actin密度指數(shù)之比來(lái)表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間比較采用方差分析法，相關(guān)性分析采用Spearman法，顯著性檢驗(yàn)水平為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 RPM對(duì)PC-2細(xì)胞增殖的影響 不同濃度的RPM作用于 PC-2細(xì)胞0、24、48和72 h后，對(duì) PC-2細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，呈時(shí)間和濃度的依賴性，隨藥物作用時(shí)間延長(zhǎng)和濃度增加，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率逐漸升高，50 nmol/L的RPM作用96 h引起的生長(zhǎng)抑制率明顯高于其他濃度組的抑制率(P ＜0.05)，高達(dá)(82.5 ±5.4)%(圖1)。

圖1 RPM對(duì)PC-2細(xì)胞增殖的抑制作用

2.2 RPM對(duì)PC-2細(xì)胞凋亡的影響 正常對(duì)照組PC-2細(xì)胞凋亡率為(3.27 ±1.43)%;10～50 nmol/L RPM組作用24 h后PC-2細(xì)胞凋亡率分別為(8.53±2.14)%、(17.58 ± 4.10)%、(39.24 ±5.66)%、(51.30 ±4.12)% 和(64.81 ±7.52)%，結(jié)果顯示10～50 nmol/L RPM均能誘導(dǎo)不同程度的細(xì)胞凋亡(P ＜0.05或P ＜0.01);且10～30 nmol/L RPM 組以早期凋亡細(xì)胞為主，隨著RPM濃度的增高，晚期凋亡細(xì)胞明顯增多(圖2)。

圖2 RPM誘導(dǎo)PC-2細(xì)胞凋亡的AnnexinV-FITC/PI雙標(biāo)染色及流式細(xì)胞術(shù)分析

2.3 RPM對(duì)胰腺癌PC-2細(xì)胞mTOR mRNA表達(dá)的影響 反轉(zhuǎn)錄-PCR結(jié)果顯示，未經(jīng)RPM處理的PC-2細(xì)胞中mTOR mRNA水平較高，其中空白對(duì)照組、10～50 nmol/L RPM組mTOR mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為:127.35 ± 7.52、104.31 ± 6.31、96.52 ± 4.24、53.60 ±5.13、50.09 ±4.12、21.43 ±2.42。與空白對(duì)照組相比，藥物處理組mRNA相對(duì)表達(dá)量均有不同程度的抑制效應(yīng);而且隨著RPM濃度增高，mTOR mRNA水平表達(dá)逐漸降低(圖3A，圖3B)。RPM與mTOR mRNA表達(dá)間呈現(xiàn)較好的劑量依賴性關(guān)系(P ＜0.05)。

圖3A 不同濃度的RPM處理12 h后PC-2細(xì)胞中mTOR mRNA的表達(dá)

圖3B 不同濃度的RPM處理12 h后PC-2細(xì)胞中mTOR mRNA的表達(dá)

3 討論

mTOR是一種進(jìn)化非常保守的蛋白激酶，廣泛地存在于多種生物細(xì)胞中。近年來(lái)的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，mTOR在細(xì)胞蛋白質(zhì)合成、能量平衡中起關(guān)鍵作用，從而影響細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的很多方面，包括細(xì)胞分化、細(xì)胞周期進(jìn)程、新生血管生成、蛋白降解和細(xì)胞凋亡等。mTOR可被許多致瘤信號(hào)所激活，例如，表皮生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等生長(zhǎng)因子受體的活化或突變、PTEN抑癌基因的沉默、磷脂酰肌醇3激酶催化亞型的激活、Akt基因的擴(kuò)增以及Ras-Raf-MEK通路的激活［1］。

RPM是一種親脂性三烯含氮大環(huán)內(nèi)酯抗生素類免疫抑制藥，是最早被發(fā)現(xiàn)的mTOR抑制劑。RPM通過(guò)調(diào)節(jié)mTOR通路從而抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，同時(shí)也可以抑制宿主免疫應(yīng)答［2］?，F(xiàn)主要用于防治腎、肝等器官移植的排斥反應(yīng)［3］。其主要不良反應(yīng)為高血脂和骨髓抑制作用，長(zhǎng)期應(yīng)用耐受良好。以往的研究證實(shí)，RPM具有濃度依賴性地抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的活性，例如肉瘤、膀胱癌、肝癌等［4-6］。本實(shí)驗(yàn)中不同濃度的RPM作用于PC-2細(xì)胞0～96 h后，對(duì)PC-2細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，表現(xiàn)為呈時(shí)間和濃度的依賴性，隨藥物作用時(shí)間延長(zhǎng)和濃度增加，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制效應(yīng)逐漸增強(qiáng)。

mTOR抑制劑是否能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，目前尚有爭(zhēng)議。在胰腺癌中，mTOR抑制劑可抑制幾乎所有p53缺陷的癌細(xì)胞株的生長(zhǎng)［7］。研究發(fā)現(xiàn)，RPM誘導(dǎo)凋亡的能力可能依賴于細(xì)胞內(nèi)p53的水平［8］。在缺乏功能性p53的橫紋肌肉瘤中，RPM抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)大量細(xì)胞凋亡;但功能性p53的表達(dá)則保護(hù)肉瘤細(xì)胞逃逸RPM誘導(dǎo)的凋亡。對(duì)于高表達(dá)Akt的淋巴瘤，mTOR抑制劑能顯著增加化療誘導(dǎo)的凋亡［9］。Huang 等［10］的研究揭示，RPM 不僅能引起腫瘤細(xì)胞周期阻滯，還可誘導(dǎo)p53功能缺失所致的細(xì)胞凋亡。其可能機(jī)制為RPM能夠誘導(dǎo)凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)酶1激活，并可延遲其激活時(shí)間，同時(shí)也能夠激活C-Jun N端酶的活性，提高磷酸化的C-Jun的含量，凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)酶1和磷酸化的C-Jun都能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)［11］。Fechner等［12］的研究中可抑制人膀胱癌細(xì)胞的增殖但不能有效地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時(shí)發(fā)現(xiàn)RPM可減少缺氧導(dǎo)致的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子合成。本研究中流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)RPM具有誘導(dǎo)PC-2細(xì)胞凋亡的作用，且隨著藥物濃度的提高，凋亡率增高，存在一定的劑量依賴關(guān)系。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示:正常對(duì)照組、10～50 nmol/L RPM組PC-2細(xì)胞凋亡率分別為(3.27 ± 1.43)%、(8.53 ± 2.14)%、(17.58 ±4.10)%、(39.24 ±5.66)%、(51.30 ±4.12)% 和(64.81 ±7.52)%，提示10～50 nmol/L RPM 均能誘導(dǎo)不同程度的細(xì)胞凋亡(P＜0.05或 P＜0.01);且10～30 nmol/L RPM組以早期凋亡細(xì)胞為主，隨著RPM濃度的增高，晚期凋亡細(xì)胞明顯增多。

RT-PCR結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，RPM處理組mRNA相對(duì)表達(dá)量均有不同程度的抑制效應(yīng);而且隨著RPM濃度增高，mTOR mRNA水平表達(dá)逐漸降低(圖3A、3B)。RPM與mTOR mRNA表達(dá)間表現(xiàn)出較好的劑量依賴性關(guān)系(P＜0.05)。

綜上所述，RPM可有效抑制胰腺癌PC-2細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與下調(diào)mTOR基因表達(dá)有關(guān)。

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