李艷平 唐金寶 林志娟 肖偉玲 梁淑娟 (濰坊醫(yī)學院山東省免疫學重點實驗室,濰坊 261053)

葡萄球菌A蛋白(Staphylococcal protein A,SpA)是金黃色葡萄球菌細胞壁上的一類功能特殊的蛋白質(zhì),因其能與IgG的Fc區(qū)域結(jié)合而備受關注。SpA有E,D,A,B,C 5個高度同源的IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域,可與人和多種哺乳動物IgG抗體的Fc段非特異性結(jié)合,且這種結(jié)合不影響Fab片段與抗原特異性結(jié)合的免疫活性[1],根據(jù)這一特性,SpA不僅用于IgG和單克隆抗體的純化,還被多種標記物(如過氧化物酶、膠體金等)偶聯(lián)標記用于免疫測定;因SpA與IgG結(jié)合不受種屬限制,被稱為“廣泛二抗”[1]。ZZ親和肽是源于SpA的D,A,B,C結(jié)構(gòu)域改造而來,Mr僅為14×103,且保留了IgG結(jié)合活性[2],本實驗利用大腸桿菌表達了C端帶有6×His的ZZ親和肽,經(jīng)Ni2+親和純化并對其生物學活性進行了測定。

1 材料與方法

1.1 材料 含ZZ親和肽基因的pEZZ18、pUC18質(zhì)粒及E.coli DH5α、E.coli HB101均為本室保存;PMD18-T載體、Ex Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、HindⅢ、DL1000 DNA Marker 及蛋白質(zhì)分子量標準均購自TaKaRa公司;兔IgG抗體、山羊抗兔IgG-HRP(氧化法標記)購自北京中衫金橋生物公司;BSA(IgG Free)購自BBI公司;BCA Protein Assay Kit購自武漢博士德生物公司;His Trap層析柱購自GE Healthcare;其他試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。

1.2 方法

1.2.1 ZZ親和肽基因序列的擴增及載體的構(gòu)建根據(jù)ZZ親和肽基因序列設計引物:上游引物:5′-CCGGAATTCCATGGCGCAACACGATGAAG-3′,下游引物 :5′-CCCAAGCT TTTTATGATGATGATGATGATGATT-CGCGTC-3′,分別設計了EcoRⅠ和HindⅢ 酶切位點,引物由上海博尚公司合成。以pEZZ18為模板,PCR擴增ZZ親和肽基因。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳純化后,連接到PMD 18-T simple vector,轉(zhuǎn)化E.coli DH5α。質(zhì)粒擴增后測序(委托大連寶生物工程有限公司)。對測序正確的克隆載體經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切回收ZZ基因片段,連接至經(jīng)同樣酶切的pUC 18載體,轉(zhuǎn)化E.coli HB101,構(gòu)建pUC-ZZ/E.coli HB101工程菌。

1.2.2 ZZ親和肽的表達及純化 pUC-ZZ/E.coli HB101工程菌過夜活化,按5%接種量轉(zhuǎn)接于新鮮的LB培養(yǎng)基(氨芐青霉素濃度100 μ g/ml),37℃振蕩培養(yǎng)至A600nm為0.3～0.5,加IPTG至終濃度為1mmol/L誘導6小時,離心收集菌體。以含20 mmol/L咪唑的PBS溶液重懸菌體,超聲破壁,10 000 r/min離心分離菌體碎片,上清0.22 μ m濾膜過濾后,0.5 ml/min流通HisTrap層析柱,以含20 mmol/L咪唑的PBS溶液沖洗層析柱至A280值不再變化。以含500 mmol/L咪唑的PBS洗脫,收集洗脫液,超濾離心管5 000 r/min離心,脫鹽濃縮至合適體積。

1.2.3 ZZ親和肽與IgG抗體的結(jié)合活性測定 利用競爭ELISA測定法測定ZZ親和肽與兔IgG抗體的親和活性。以兔IgG抗體(100 ng/ml)4℃過夜包被酶標板,0.5%的BSA封閉,PBST洗滌5分鐘×3次,對經(jīng)BCA法確定濃度的ZZ親和肽系列稀釋后,與山羊抗兔 IgG-HRP(1∶3 000)按體積比 1∶1混勻后;每孔加入100 μ l,于37℃反應結(jié)合1小時,PBST洗滌5分鐘×3次;加入TMB底物液200 μ l/孔,37℃避光顯色,當對照孔出現(xiàn)明顯顏色反應時,2 mol/L H2SO450 μ l/孔終止反應,測定450 nm 各孔OD值。

以僅加山羊抗兔IgG-HRP孔的A值為B0值,加入不同濃度的ZZ親和肽與山羊抗兔IgG-HRP混合液A值為B值。以ZZ親和肽的濃度負對數(shù)(-LogC)為橫坐標,以山羊抗兔 IgG-HRP百分結(jié)合率(B/B0%)為縱坐標,繪制抑制標準曲線。當山羊抗兔IgG-HRP百分結(jié)合率為50%時所對應的ZZ親和肽濃度,其濃度倒數(shù)即為ZZ親和肽與兔IgG抗體的相對親和常數(shù)[3]。

2 結(jié)果

2.1 ZZ基因片段擴增與克隆 以pEZZ18為模板,PCR擴增ZZ親和肽基因序列,預計擴增片段為412 bp。電泳結(jié)果顯示,約在400 bp的位置出現(xiàn)擴增片段(圖1左圖)。測序結(jié)果表明所擴增的ZZ序列與GeneBank數(shù)據(jù)庫中(No.M74186.1)序列完全一致。

2.2 表達質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 用EcoRⅠ/HindⅢ內(nèi)切酶雙酶切,從經(jīng)測序正確T載體上切下ZZ基因序列,克隆重組質(zhì)粒 pUC18載體,構(gòu)建表達載體pUC-ZZ。經(jīng)酶切鑒定,可見載體片段與400 bp左右的插入片段(圖1右圖)。

2.3 ZZ親和肽的誘導表達與純化 含有重組質(zhì)粒pUC-ZZ的E.coli HB101工程菌經(jīng)IPTG誘導后,SDSPAGE分析顯示,在Mr 16 000處的出現(xiàn)明顯條帶,其相對分子量與目的蛋白的理論分子量一致,判定重組蛋白獲得表達。菌體超聲破碎后的上清經(jīng)HisTrap層析柱一步純化后,獲得電泳純度80%以上的目的蛋白,見圖2。

圖1 PCR擴增及重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定Fig.1 Recombinant plasmid was identified by EcoRⅠ/HindⅢand PCR

圖2 ZZ親和肽誘導表達及純化后的SDS-PAGE圖譜Fig.2 SDS-PAGE analysis of expression and purification of ZZ protein

圖3 ZZ親和肽與山羊抗兔IgG-HRP競爭結(jié)合兔IgG抗體曲線Fig.3 The curve of competitive binding rabbit IgG between ZZ and goat anti-rabbit IgG-HRP

圖4 ZZ親和肽與兔IgG抗體親和活性的測定Fig.4 Inhibition curve of ZZ affibody by competitive ELISA

2.4 ZZ親和肽與IgG抗體的結(jié)合活性 競爭ELISA法中,待測物質(zhì)的濃度與OD值成反比。實驗結(jié)果顯示,A450值隨著反應體系中ZZ親和肽濃度降低而增大,說明ZZ親和肽與山羊抗兔IgG-HRP競爭結(jié)合反應體系中的兔IgG抗體(圖3)。在本試驗條件下,利用競爭結(jié)合法所測的ZZ親和肽與兔IgG抗體的相對親和常數(shù)為Ka≌1.45×108L/mol(圖4)。

3 討論

SpA是金黃色葡萄球菌細胞壁分離的蛋白質(zhì),其Mr為42×103,研究發(fā)現(xiàn)SpA的5個高度同源的IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域中,也與某些IgG的Fab段結(jié)合[如人IgG1的F(ab′)2],而以人工修飾的ZZ結(jié)構(gòu)域代替其5個結(jié)構(gòu)域,僅保留了IgG抗體Fc段結(jié)合的性能,特異性更強[2]。本實驗中以質(zhì)粒pEZZ18為模板,擴增C端帶有6×His標簽的ZZ親和肽,并將該片段克隆至pUC18載體中,構(gòu)建了融合表達系統(tǒng),經(jīng)IPTG誘導,目的蛋白在大腸桿菌獲得大量表達,表達產(chǎn)物主要以可溶狀態(tài)存在。菌體超聲破壁上清經(jīng)HisTrap柱分離純化,獲得較高純度的重組ZZ親和肽?？贵w的親和力是指抗體與抗原結(jié)合的緊密程度,常用親和常數(shù)來表示,本實驗采用常用的競爭結(jié)合法測定ZZ親和肽的親和常數(shù),本實驗僅測定了ZZ親和肽與兔IgG抗體的親和常數(shù),與其他來源IgG抗體的親和常數(shù)尚需進一步的測定。

免疫微陣列中抗體的固定化是至關重要的環(huán)節(jié),理想的固定化技術應該實現(xiàn)抗體的定向固定。目前抗體的固定方法主要有物理吸附法和化學共價交聯(lián)法[4],用這兩種方法固定抗體,在固定結(jié)合過程中抗體的Fab端有可能被掩蓋而失去結(jié)合抗原的能力,或固定的抗體在分析過程中易被洗脫,從而降低了應用時的靈敏度和重復性[5,6]。本實驗利用大腸桿菌成功表達ZZ親和肽,利用其與多種哺乳動物IgG抗體Fc段結(jié)合的特性,不僅在免疫測定中可作為一種替代二抗[7,8],在免疫微陣列中亦具有潛在的應用前景,如先將ZZ親和肽固定化后,利用其特性將IgG的Fc端固定在載體上,使得Fab端從載體的表面充分向空間展示而實現(xiàn)抗體的定向固定化,更有利于抗體捕捉體系中的抗原,進一步提高免疫傳感器的靈敏度。因此進一步開發(fā)ZZ親和肽在免疫微陣列中的應用將是下一步研究的重點。

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