王 斌 劉一兵 馮婷婷 許文革 韓世泉 (中國原子能科學(xué)研究院同位素研究所,北京 102413)

孕酮(Progesterone)是一種甾體類激素,其分子量為314,具有△4-3-酮基的21碳甾體結(jié)構(gòu),主要由卵巢的黃體細(xì)胞產(chǎn)生。孕酮主要作用于子宮內(nèi)膜和子宮肌,它是受精卵著床和維持妊娠所必需的激素[1]。由于子宮孕酮受體的含量受雌激素調(diào)節(jié),因此,在正常的女性體內(nèi),孕酮和其他雌激素共同發(fā)生作用,在對立統(tǒng)一的過程中調(diào)節(jié)著生殖活動。孕酮的主要生物學(xué)作用是參與識別妊娠和維持妊娠。孕酮在血液中,主要是與蛋白質(zhì)結(jié)合的形式存在,只有1%是以游離狀態(tài)存在,檢測血液孕酮總量,對于妊娠診斷、不孕癥診斷,以及卵巢機(jī)能、生殖障礙和產(chǎn)科疾病的研究等有重要意義。臨床檢驗(yàn)血清中孕酮含量的檢測方法主要有免疫分析法、色譜法、熒光法等,而臨床上應(yīng)用最廣泛的主要是免疫分析法。免疫分析法在甾體類激素分析方法的發(fā)展中具有重要的地位,主要的測量方法有:放射免疫分析(Radioimmunoasay,RIA)法、酶免疫分析(Enzyme immunoassay,EIA)法、化學(xué)發(fā)光免疫分析(Chemiluminescence immunoassay,CLIA)法。

放射免疫分析(RIA)法有許多其它分析方法無可比擬的優(yōu)點(diǎn)[2]:①靈敏度高:測定激素含量可達(dá)10-9g/ml水平,由于高比度標(biāo)記化合物制備技術(shù)的改進(jìn),靈敏度向10-12g/ml水平發(fā)展。②特異性強(qiáng);③應(yīng)用范圍廣:小分子量的激素與肽類物質(zhì)、藥物和體內(nèi)的活性物質(zhì)都可用RIA來測定。

酶免疫分析(EIA)法具有迅速、成本低、無放射性污染、無需昂貴儀器設(shè)備、精度較好等優(yōu)點(diǎn)[3]。其分析模式主要有兩類:①酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)法:是將酶促反應(yīng)的放大作用與抗原-抗體反應(yīng)的特異性結(jié)合起來的一種酶免疫化學(xué)測定法。它與RIA不同的是以酶代替同位素作為示蹤物,既可用于孕酮的定性分析,又可用于定量分析。在妊娠應(yīng)用中以定量分析為主;②孕酮均相酶聯(lián)免疫分析法:此法原理與ELISA基本相同,只是標(biāo)記酶與ELISA不同。該系統(tǒng)的孕酮-HRP與抗體結(jié)合后,酶便失去催化底物的活性,而游離的孕酮-HRP還有催化底物的活性,并可催化底物產(chǎn)生有色反應(yīng),且其OD450nm值與被測物的含量呈正相關(guān)。

化學(xué)發(fā)光免疫分析(CLIA)法因其自動化程度高,檢測速度快,可以滿足大批量樣品檢測的要求,近年來在臨床實(shí)驗(yàn)室的使用有逐年上升的趨勢[4]。

1 材料與方法

1.1 主要儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱為美國Forma Scientific公司產(chǎn)品;臺式高速離心機(jī)為德國HERMLE公司產(chǎn)品;紫外分光檢測儀為美國Varian公司產(chǎn)品;倒置顯微鏡為日本Olympus公司產(chǎn)品;Spectra酶標(biāo)儀為奧地利SLT公司產(chǎn)品;伽瑪計(jì)數(shù)器(GAMMAC12),美國DPC公司;微量滴定板為美國Corning公司產(chǎn)品;辣根過氧化物酶(HRP)為美國Sigma公司產(chǎn)品;牛血清白蛋白為上海賽達(dá)生物有限公司產(chǎn)品;臨床樣品由醫(yī)院提供。

1.2 主要 試劑 11α-OH-孕 酮-琥 珀 酸 脂-BSA(Q3253)為Steroids公司產(chǎn)品;96孔酶標(biāo)板和96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、美國Corning公司產(chǎn)品;弗氏不完全佐劑、DMEM培養(yǎng)基 、谷氨酰胺、HAT、HT、PEG 、辣根過氧化物酶(HRP)、牛血清白蛋白(BSA)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)、N,N′-二環(huán)已基碳二亞胺(DCC)、N-羥琥珀酰亞胺 (NHS)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、尿素過氧化氫是美國Sigma公司產(chǎn)品;蛋白G親和層析柱是美國GE公司產(chǎn)品;ANS(10417)為Fluka公司產(chǎn)品;孕酮放射免疫分析試劑盒(國藥準(zhǔn)字S10950123)由原子高科股份有限公司提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 單克隆抗體的制備[5,6]

1.3.1.1 小鼠免疫 用11α-OH-孕酮-BSA免疫6～8周齡BALB/c小鼠,采用頸背部皮下多點(diǎn)注射方法進(jìn)行免疫。初次免疫劑量為40 μ g/只,隔兩周進(jìn)行第二次免疫,以后每隔四周免疫一次,免疫劑量均為20 μ g/只。四次免疫后,眼底采血,采用放射免疫分析(RIA)方法測其抗血清滴度。

1.3.1.2 雜交瘤細(xì)胞株的建立 ①細(xì)胞融合:融合前三天每天對待融合小鼠進(jìn)行腹腔注射加強(qiáng)免疫,每次免疫量為 20 μ g。取小鼠脾細(xì)胞與Sp2/0細(xì)胞在50%PEG作用下融合。融合后細(xì)胞置于HAT培養(yǎng)基中,鋪到含有巨噬細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板中,于37℃,5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。②篩選:融合7～8天后,待雜交瘤細(xì)胞生長至1/4孔大小時,取上清液,采用放射免疫分析方法或酶聯(lián)免疫分析方法進(jìn)行篩選。③克隆化:采用有限稀釋法對呈陽性的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆化,待克隆后的細(xì)胞生長至1/4孔大小時再進(jìn)行篩選、克隆,直至所有細(xì)胞生長孔的上清均為陽性為止。

1.3.2 抗體的純化 采用Protein-G親和層析柱對小鼠腹水進(jìn)行純化,具體步驟如下:①用0.02 mol/L pH 7.4的PB平衡親和層析柱;②將1 ml小鼠腹水上柱;③用0.02 mol/L pH 7.4的PB洗脫雜蛋白;④待雜蛋白洗脫干凈后,用0.1 mol/L pH 2.8的Gly-HCl緩沖液洗脫目的蛋白并進(jìn)行收集,同時用適量的0.2 mol/L pH 9.0的Na2HPO4對收集溶液進(jìn)行中和;⑤將收集的目的蛋白對0.02mol/L pH 7.4的PB完全透析。

1.3.3 抗體親和常數(shù)的測定[7]配制孕酮標(biāo)準(zhǔn)品:0、0.3、1.5、6.0、20、50、100 ng/ml,加入到放射免疫分析測量管中(100 μ l/管),再將小鼠腹水用樣品稀釋液稀釋到一定倍數(shù),加入到放射免疫分析測量管中(100 μ l/管),再加入125I標(biāo)記的孕酮(100 μ l/管),37℃溫育3小時;加入分離試劑(500 μ l/管),再加入100 μ l含有3%正常小鼠血清溫育液,混勻后,3 500 r/min離心15分鐘;棄去上清,在γ-計(jì)數(shù)器上測量管中的放射性計(jì)數(shù)。采用Scatchard作圖法計(jì)算出抗體的親和常數(shù)。

1.3.4 交叉反應(yīng)率的測定[8]將交叉物分別配制成濃度為 1.0 ng/ml、10 ng/ml、100 ng/ml、1 μ g/ml、10 μ g/ml加入到放射免疫分析測量管中(100 μ l/孔),然后加入125I-P(100 μ l/管),再加入稀釋到一定倍數(shù)的小鼠腹水(100 μ l/孔),37℃溫育3小時;加入分離試劑(500 μ l/管)和含有3%正常小鼠血清溫育液(100 μ l/管),混勻后,3 500 r/min 離心 15 分鐘;棄去上清,測量cpm/管。以孕酮為標(biāo)準(zhǔn)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,由公式:交叉反應(yīng)率=([Y]50/[Z]50)×100%,計(jì)算抗體的交叉反應(yīng)率(式中[Y]50指類似物物在結(jié)合率為50%時所對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)濃度值;[Z]50為類似物在結(jié)合率為50%時所對應(yīng)的濃度值)。

1.3.5 酶標(biāo)抗原的制備 采用碳二亞胺法來制備酶標(biāo)抗原[9,10]。①1.0 mg孕酮-11α-半琥珀酰溶于DMSO中,濃度為3.33 mg/ml;NHS溶于DMSO中,濃度為1 mg/ml;DCC溶于DMSO中,濃度為10 mg/ml。②1.0 mg HRP溶于0.2mol/L Na2CO3中,濃度為0.7 mg/ml;EDC溶于 0.2 mol/L Na2CO3中,濃度為10 mg/ml;③向孕酮-11α-半琥珀酰溶液中加入上述DCC和NHS溶液各 20 μ l,室溫?cái)嚢?2小時;④向HRP溶液中攪拌加入上述EDC和NHS溶液各30 μ l。取1 ml該反應(yīng)溶液加入③中的孕酮-11α-半琥珀酰溶液中,避光在4℃下攪拌2小時后,放置在4℃下過夜。⑤用0.02 mol/L pH 7.4 PB緩沖溶液透析,然后加入等體積甘油,放置在-20℃保存。

1.3.6 標(biāo)準(zhǔn)品的制備 用正常男性血清作為基質(zhì)配制孕酮標(biāo)準(zhǔn)品,標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為0.3、1.5、6.0、20、50、100 ng/ml;用去激素血清作為“0”標(biāo)準(zhǔn)品溶液;當(dāng)測量各個標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的孕酮含量恒定時,將其分裝0.5 ml/瓶、凍干、加入干燥劑并在4℃下保存。

1.3.7 孕酮酶聯(lián)免疫分析程序[11,12]在包被有抗體的酶標(biāo)板中,每孔加入 100 μ l標(biāo)準(zhǔn)品/血樣、50 μ l 1-苯氨基萘-8-磺酸(ANS)、50 μ l酶標(biāo)抗原混勻 37℃反應(yīng)3小時;用洗滌液洗滌4遍,加入100 μ l顯色底物,37℃顯色15分鐘,最后加入50 μ l 2 mol/L H2SO4終止反應(yīng),測定OD450nm。

在此步實(shí)驗(yàn)中,使用了阻斷劑ANS,使得血清中的孕酮從結(jié)合蛋白上解離下來,能夠進(jìn)行準(zhǔn)確地測量血清中孕酮總量。從已制備的14株抗孕酮的單克隆抗體中選擇出一株抗阻斷能力強(qiáng)的抗孕酮的單克隆抗體11F8(3)H5,來建立孕酮酶聯(lián)免疫分析方法。

2 結(jié)果

2.1 抗孕酮單克隆抗體親和常數(shù)的測定 采用Scatchard作圖法計(jì)算出每株抗體的親和常數(shù)(K),實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

2.2 抗孕酮單克隆抗體的交叉反應(yīng)率 交叉物用去激素血清配成1.0 ng/ml、10 ng/ml、100 ng/ml、1.0 μ g/ml、10 μ g/ml的 5 個濃度溶液 ,采用 RIA 法 ,測量各株抗體的交叉反應(yīng)率,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示,得到的14株單抗與11β-OH-孕酮有一定交叉,但交叉率都比較小,與其余5種甾體類激素的交叉反應(yīng)率都＜0.1%。

2.3 孕酮酶聯(lián)免疫分析方法學(xué)的鑒定

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及靈敏度 孕酮酶聯(lián)免疫分析標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖1所示),曲線方程為:y=-0.59ln(x)-0.491 6,r=0.997 2。同時測定20個零標(biāo)準(zhǔn)的OD450nm,取其平均值,計(jì)算-2SD為 y值,并將此值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中,計(jì)算出對應(yīng)的濃度為0.12 ng/ml,即為本方法學(xué)的靈敏度。

2.3.2 健全性實(shí)驗(yàn) 取一份高值的孕酮血清樣品進(jìn)行倍比稀釋并測定其孕酮含量?？疾煜♂尪群蜏y定值線性相關(guān)性,結(jié)果為:y=54.595x+1.306,r=0.995 7,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

表1 抗孕酮單克隆抗體的親和常數(shù)Tab.1 Affinity constant of anti-progesterone antibodies

表2 抗孕酮單克隆抗體的交叉反應(yīng)率Tab.2 Cross reaction rate of anti-progesterone antibodies

圖1 孕酮酶聯(lián)免疫分析標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve for Progesterone assay

圖2 健全性實(shí)驗(yàn)Fig.2 Correlation coefficient of dilution experiment

表3 批內(nèi)、批間變異Tab.3 Intra-assay and inter-assay CVs

表4 回收率測定結(jié)果Tab.4 Analytical recovery of progesterone

2.3.3 精密度實(shí)驗(yàn) 對3份不同濃度的孕酮的血清樣品分別在一次實(shí)驗(yàn)中平行測量多孔和在不同實(shí)驗(yàn)中重復(fù)測量多次,計(jì)算批內(nèi)變異和批間變異系數(shù),實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。本方法的批內(nèi)變異系數(shù)為:7.5%～11.4%;批間變異系數(shù)為:8.2%～12.1%。

2.3.4 回收率實(shí)驗(yàn) 向兩份含不同濃度孕酮的臨床樣品中加入已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品,然后對其進(jìn)行測量并計(jì)算回收率,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示,本方法的回收率是93.8%～124.7%。

2.4 方法學(xué)比較 本方法與酶促化學(xué)發(fā)光分析方法測定28份血清樣品孕酮濃度,結(jié)果示于圖3,相關(guān)方稱為:y=0.780 4x+0.7600,相關(guān)系數(shù) r=0.912 6。

圖3 酶聯(lián)免疫分析方法與酶促化學(xué)發(fā)光分析方法的相關(guān)曲線Fig.3 Relationship between ELISA and CLIA

3 討論

孕酮是懷孕早期預(yù)兆流產(chǎn)的檢測指標(biāo),臨床應(yīng)用廣泛。目前國內(nèi)檢測孕酮的試劑盒所使用的抗體主要依靠進(jìn)口,所以本課題進(jìn)行抗孕酮的單克隆抗體的制備及其在酶聯(lián)免疫分析中的初步應(yīng)用,因?yàn)閱慰寺】贵w具有特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、重復(fù)性好、可無限生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn),我們通過免疫BALB/c小鼠,采用雜交瘤技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞融合獲得14株抗孕酮的單克隆抗體。對所得單抗進(jìn)行鑒定,制備得到了14株抗孕酮單克隆抗體,抗體的親和常數(shù)為1.9×108～6.5×108mol/L;與甾體類激素的交叉反應(yīng)率均較小。

選擇11F8(3)H5這株抗體建立酶聯(lián)免疫分析方法,其測量范圍為:0.3～100 ng/ml,靈敏度為:0.12 ng/ml,批內(nèi)變異與批間變異分別為:7.5%～11.4%與8.2%～12.1%,回收率為:93.8%～124.7%,稀釋實(shí)驗(yàn)測定值與稀釋度呈線性相關(guān),相關(guān)系數(shù)r為:0.995 7。與酶促化學(xué)發(fā)光分析方法測定血清樣品的孕酮濃度值進(jìn)行比對,相關(guān)性方程為:y=0.789 4 x+0.7600,r=0.912 6。抗孕酮的單克隆抗體的初步應(yīng)用,為檢測孕酮酶聯(lián)免疫分析試劑盒的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

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