丁浩強(qiáng) 葉 欣 羅廣平 陳揚(yáng)凱 (廣州血液中心,廣州 510095)

短串聯(lián)重復(fù)序列(Short tandem repeat,STR)是指基因組中小于10個(gè)核苷酸的簡(jiǎn)單重復(fù)序列,又稱微衛(wèi)星序列(Microsatellite,MS)或者簡(jiǎn)單重復(fù)序列(Simple sequence repeats,SSR),一般為2～6個(gè)堿基重復(fù),如(CA)n、(GT)n、(CAG)n 等,尤以(CA)n 重復(fù)序列最為常見,其長(zhǎng)度由重復(fù)單位的拷貝數(shù)決定。STR在整個(gè)基因組中廣泛分布,平均每10 kb出現(xiàn)一個(gè),根據(jù)GenBank等數(shù)據(jù)庫(kù)的資料統(tǒng)計(jì),23對(duì)染色體上至少分布著7 901個(gè)STR基因座[1],其重復(fù)單位數(shù)目的改變使之具有高度多態(tài)性,但STR基因座的突變率介于0～0.492%[2],在家系中可以穩(wěn)定遺傳。因此可應(yīng)用于移植術(shù)后監(jiān)測(cè)、遺傳制圖、遺傳距離、基因定位、法醫(yī)學(xué)鑒定、人類學(xué)以及遺傳病(如先天愚型21三體)診斷等許多領(lǐng)域的研究中[3-6]。我們通過(guò)對(duì)156名廣州地區(qū)漢族無(wú)關(guān)個(gè)體的STR位點(diǎn)分型統(tǒng)計(jì),建立了 D8S1179、D21S11、D7S820、CSF1PO、D3S1358、TH01、D13S317、D16S539、D2S1338 、D19S433、vW A 、TPOX 、D18S51、D5S818、FGA 等 15個(gè)位點(diǎn)的群體遺傳學(xué)資料,并對(duì)其在廣州地區(qū)漢族人群的遺傳標(biāo)記指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集 收集156份廣州地區(qū)漢族無(wú)親緣關(guān)系個(gè)體靜脈血(檸檬酸鈉抗凝)2～3 ml,淋巴細(xì)胞分離液(密度=1.077 L)分離白膜層。用QIAGEN DNA提取試劑盒(QIAGEN公司)提取DNA,詳細(xì)步驟見試劑盒說(shuō)明書。

1.2 PCR復(fù)合擴(kuò)增 采用Applied Biosystems公司AmpFl STR○RIdentifilerTM試劑盒擴(kuò)增,檢測(cè) D8S1179、D21S11、D7S820、CSF1PO、D3S1358、TH01、D13S317、D16S539、D2S1338、D19S433、vWA 、TPOX、D18S51、D5S818、FGA共15個(gè)STR基因座和Amelogenin性別基因座,詳細(xì)操作參照說(shuō)明書。

1.3 數(shù)據(jù)分析 記錄每個(gè)樣本的基因型,計(jì)算等位基因頻率,對(duì)所得群體遺傳學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn),依據(jù)Modified-powerstate標(biāo)準(zhǔn)版計(jì)算法醫(yī)學(xué)遺傳標(biāo)記評(píng)價(jià)指標(biāo),包括雜合度(Heterozygosity,H)、多態(tài)性信息含量(Polymorphism information contents,PIC)、匹配概率(Probability of matching,Pm)、個(gè)體識(shí)別力(Discrimination power,DP)和非父排除概率(Excluding probability of paternity,EP)。

2 結(jié)果

2.1 無(wú)血緣關(guān)系個(gè)體的基因型 15個(gè)STR基因座在所觀察的156份樣本中的等位基因頻率見表1,根據(jù)各樣本基因型及等位基因頻率,經(jīng) χ2檢驗(yàn)表明,各基因座的群體基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05)。

2.2 群體遺傳學(xué)多態(tài)性參數(shù)統(tǒng)計(jì)指標(biāo) 根據(jù)基因型及等位基因頻率(表1)檢測(cè)結(jié)果,統(tǒng)計(jì)15個(gè)STR基因座的雜合度、多態(tài)性信息含量、匹配概率、個(gè)體識(shí)別力和非父排除概率。

表1 15個(gè)STR基因座等位基因頻率和Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)Tab.1 The frequences of 15 STR loci and Hardy-Weinberg Equilibrium test

(續(xù)表1)

(續(xù)表1)

3 討論

STR基因座的等位基因片段比較短,一般小于500 bp,尤以300 bp以下的擴(kuò)增片段居多;STR基因座擴(kuò)增后基因型之間相差堿基數(shù)目少,一般小于5 bp,易同時(shí)有效擴(kuò)增;提高了微量生物檢材的有效利用;多個(gè)STR基因座的擴(kuò)增條件大致相同,即可進(jìn)行多重PCR(Multiplex PCR)。本研究對(duì)廣州地區(qū)漢族隨機(jī)群體的數(shù)據(jù)顯示:所有位點(diǎn)的等位基因頻率均符合Hardy-Weinberg平衡,在所檢測(cè)的156例樣本15個(gè)STR基因座中,FGA的基因型分布最廣(57種)、等位基因也最多(23個(gè))、其核心序列最大重復(fù)次數(shù)為30,屬?gòu)?fù)雜重復(fù)序列。等位基因頻率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)一些罕見等位基因,如D21S11等位基因34、D7S820等位基因 9.2、D13S317等位基因 7、FGA等位基因26.2、30,這些等位基因在美國(guó)白種人群中均未檢測(cè)到,這可能與本研究樣本量和所參考文獻(xiàn)的樣本量有關(guān)[7-10],也可能是中國(guó)人與美國(guó)人的等位基因構(gòu)成確有差別。本研究中我們發(fā)現(xiàn)了基因分布頻率很低的FGA30,其在個(gè)體識(shí)別中卻有著重要價(jià)值。另外,也有部分位點(diǎn)的等位基因(如TPOX5、6等),在本研究和其他中國(guó)群體調(diào)查中均未發(fā)現(xiàn),但卻存在于美國(guó)人群[7]?？梢?中西方人群的STR基因型分布是有所不同的。

對(duì)廣州地區(qū)漢族人群的調(diào)查研究顯示,所選取的15個(gè)STR遺傳標(biāo)記均具有高度多態(tài)性,雜合度均超過(guò) 0.64,其 中 D8S1179、D21S11、D13S317、D2S1338、D19S433、vWA、D18S51和FGA 的雜合度均在0.8以上。PIC除TPOX外,均大于0.65,D18S51和FGA達(dá)到0.85。遺傳標(biāo)記的應(yīng)用價(jià)值用DP、EP和Pm來(lái)表示,用以反映某一遺傳標(biāo)記在法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別及親權(quán)鑒定中的能力,一般 DP＞0.8、EP＞0.5、Pm＜0.2時(shí),屬于高度多態(tài)性遺傳標(biāo)記。根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,15個(gè)基因座的 DP在 0.816～0.966之間,EP在0.343～0.725之間,Pm在0.038～0.184之間。其中FGA、D18S51三個(gè)基因座的DP＞0.962、EP＞0.7、Pm＜0.034,具有最好的應(yīng)用價(jià)值。TPOX和CSF1PO的EP略差,分別為0.343和0.388,但也達(dá)到了法醫(yī)學(xué)的應(yīng)用要求。由于15個(gè)基因座間無(wú)連鎖遺傳關(guān)系,依有關(guān)統(tǒng)計(jì)學(xué)公式計(jì)算15個(gè)基因座的累積個(gè)體識(shí)別能力為0.999 999 999 999 999 991,累積非父排除率為0.999 75,Pm值為8.84×10-18[11],因此,本研究群體遺傳資料表明,此15個(gè)STR基因座在廣州地區(qū)漢族人群中有很高的遺傳多態(tài)性,可用于移植術(shù)后供者植入狀態(tài)的監(jiān)測(cè)。

在受者移植前,供受者間會(huì)進(jìn)行HLA-A、B、C、DRB、DQB位點(diǎn)的檢測(cè)。若把HLA系統(tǒng)作為移植術(shù)后供者植入狀態(tài)監(jiān)測(cè)的手段,首先在方法學(xué)的問(wèn)題上比較困難;第二,以目前所檢測(cè)的五個(gè)位點(diǎn)來(lái)算信息量不足夠;第三,工作量會(huì)很大。因此,檢測(cè)15個(gè)STR基因座的多重PCR方法,是個(gè)理想的、可靠的選擇,優(yōu)點(diǎn)在于其單孔同時(shí)可以擴(kuò)增15個(gè)STR位點(diǎn)。本研究所檢測(cè)的15個(gè)STR基因座在移植術(shù)后供者植入狀態(tài)的監(jiān)測(cè)具有廣闊的應(yīng)用前景。

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