吉慶偉 曾秋棠 劉 伶 吳隱雄 黃 瑛 熊日新 胡昌興 吳 寧 林 虹 林英忠

(廣西自治區(qū)人民醫(yī)院心內(nèi)科,南寧 530000)

動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)是嚴(yán)重危害人類健康的最常見疾病之一,其并發(fā)癥已成為人類的主要死因。AS是一個(gè)多因素性疾病,血脂異常、高血壓、肥胖、吸煙和糖尿病等均與其發(fā)生密切相關(guān)。流行病學(xué)資料顯示,大約2/3冠狀動(dòng)脈粥樣硬化患者罹患高血壓。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究表明,高血壓合并靶器官損害與Th1細(xì)胞功能亢進(jìn)、Th1/Th2失衡有關(guān)[1-3]。我們最近的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),高血壓合并早期腎損害的患者血漿中IFN-γ和IL-17水平顯著增高并與AngⅡ正相關(guān),這提示Th1、Th17細(xì)胞功能的亢進(jìn)可能與高血壓病患者出現(xiàn)早期腎損害有關(guān)[4]。但高血壓合并動(dòng)脈粥樣硬化性疾病患者是否也存在著效應(yīng)性T細(xì)胞各亞群活性的變化目前仍未見報(bào)道,故本研究擬檢測高血壓合并頸動(dòng)脈粥樣硬化患者和對(duì)照組外周血Th1、Th2和Th17細(xì)胞比例的變化,關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子 T-bet、GATA-3 和RORγ t mRNA的表達(dá),血漿中 Th1、Th2和Th17細(xì)胞特征因子IFN-γ、IL-4和IL-17水平,探討效應(yīng)性T細(xì)胞各亞群變化與高血壓患者發(fā)生頸動(dòng)脈粥樣硬化兩者之間的可能關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 我院心內(nèi)科住院的高血壓患者45例,依據(jù)頸動(dòng)脈超聲將其分為兩組:高血壓合并頸動(dòng)脈粥樣硬化組(CA組)20例,其中男15例,女5例,平均年齡(55±9)歲;頸動(dòng)脈正常的高血壓患者(EH組)25例,其中男18例,女7例,平均年齡(58±7)歲。高血壓臨床診斷、分級(jí)符合2005年《中國高血壓防治指南》修訂版診斷標(biāo)準(zhǔn)。兩組中各有2例高血壓病2級(jí)患者,余均為高血壓病3級(jí)。對(duì)照組20例為同期在我院體檢中心的健康體檢者,均行頸動(dòng)脈超聲檢查示頸動(dòng)脈正常,其中男性14例,女性6例,平均年齡(56±10)歲。所有患者入院前均未服用或已停用影響AngⅡ的ACEI或ARB藥物一星期才抽血。

排除標(biāo)準(zhǔn)為:①繼發(fā)性高血壓患者;②臨床確診冠心病患者;③充血性心力衰竭患者;④心臟或其他部位的急、慢性炎癥患者;⑤腦卒中病史;⑥合并肝功能和(或)腎功能不良患者;⑦惡性腫瘤患者和風(fēng)濕性疾病患者;⑧高熱以及應(yīng)用炎癥抑制藥物如非甾體類抗炎藥、類固醇藥物等。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本收集 所有標(biāo)本均在患者入院24小時(shí)內(nèi)在空腹?fàn)顟B(tài)下經(jīng)肘靜脈抽血裝入肝素鈉抗凝管中,分離血漿分裝至消毒EP管后保存于-80℃冰箱用于檢測細(xì)胞因子水平,分離外周血單個(gè)核細(xì)胞用于流式細(xì)胞術(shù)檢測和RT-PCR檢測。

1.2.2 外周血Th1、Th2和Th17細(xì)胞比例的測定標(biāo)本以等體積PBS稀釋后采用人淋巴細(xì)胞分離液獲取外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC),RPMI1640調(diào)整細(xì)胞濃度至2×106ml-1,接種至24孔板后加入佛波酯(50 μ g/L)、離子霉素(1 μ mol/L)和莫能霉素(500 μ g/L),37℃5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)4小時(shí),上述試劑購自武漢博士德公司。收集細(xì)胞根據(jù)計(jì)數(shù)等分為測定管和同型對(duì)照管,加入20 μ l PE標(biāo)記的鼠抗人CD4單抗,4℃避光孵育30分鐘。PBS洗滌2次,固定液室溫避光固定反應(yīng)20分鐘后離心棄去上清,PBS洗滌2次。加入破膜劑進(jìn)行細(xì)胞打孔利于細(xì)胞因子染色,離心棄去上清后予細(xì)胞因子染色。測定管分別加入FITC標(biāo)記的鼠抗人IFN-γ、IL-4和IL-17A,對(duì)照管加入同型對(duì)照,4℃避光孵育30分鐘。上述標(biāo)記抗體均購自eBioscience公司。應(yīng)用流式細(xì)胞儀FACSAria型,根據(jù)前向散射光和側(cè)向散射光以淋巴細(xì)胞群設(shè)門,設(shè)置各通道之間的熒光補(bǔ)償后,對(duì)Th1、Th2和Th17細(xì)胞的比例進(jìn)行檢測。

1.2.3 RT-PCR檢測患者外周血T-bet、GATA3和RORγ t mRNA的表達(dá) Trizol裂解各組細(xì)胞并提取細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄后在ABI Step one實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上擴(kuò)增。RealTime RT-PCR應(yīng)用TaKaRa實(shí)時(shí)定量試劑盒配制25 μ l反應(yīng)體系。進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR所用引物如下:T-bet:上游引物5′-ATCCTTCCAG TGGTGACAGC-3′,下游引物 5′-GTCGGTGTCCTCCAAC CTAA-3′;GATA-3:上游引物 5′-GTTGGCCTAAGGTGGT-3′;下 游引物 5′-TGCACGCTGGTAGCTCATAC-3′;RORγ t:上游引物 5′-GGGAAAGTCCCAATCCTGA-3′;下游引物 5′-TCTGATCTTGCCTTCCGACT-3′;內(nèi)參照GAPDH的上下游引物如下:上游引物:5′-GGATTTGGTCGTATTGGG-3′;下 游 引 物 :5′-GGAAGATGGTGATGGGATT-3′。所得靶基因相對(duì)表達(dá)水平用CT比較法2-△△CT表示。

1.2.4 Th1、Th2和Th17細(xì)胞特征細(xì)胞因子的檢測采用雙抗夾心法(ELISA),所有操作步驟均按照說明書進(jìn)行,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣品中IFN-γ、IL-4和IL-17濃度。試劑盒購自Bender Medsystems公司。

2 結(jié)果

2.1 三組患者臨床資料的比較 CA組、EH組收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)、高血壓病史及相關(guān)用藥與對(duì)照組相較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,其余各項(xiàng)臨床資料均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。詳見表1。

2.2 三組患者Th1、Th2和Th17細(xì)胞比例的比較流式檢測各組患者PBMCs中Th1、Th2和Th17細(xì)胞比例。結(jié)果顯示CA組Th1和Th17比例明顯高于對(duì)照組和EH組(P＜0.01),而Th2比例差別無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。詳見圖1～3。

2.3 三組患者外周血T-bet、GATA3和RORγ t mRNA的表達(dá)的比較 T-bet、GATA3和 RORγ t分別是Th1、

Th2和Th17細(xì)胞的特征轉(zhuǎn)錄因子,與細(xì)胞的功能密切相關(guān)。采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測示:CA組T-betmRNA和RORγ tmRNA表達(dá)明顯高于對(duì)照組和EH組,后兩組間比較無明顯區(qū)別。GATA3mRNA表達(dá)在三組間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見圖4。

表1 三組患者臨床特征比較Tab.1 Clinical characteristics of patients

圖1 三組患者外周血Th1細(xì)胞比例FACS結(jié)果Fig.1 FACS results of Th1 frequencies in three groups

圖2 三組患者外周血Th2細(xì)胞比例FACS結(jié)果Fig.2 FACS results of Th2 frequencies in three groups

圖3 三組患者外周血Th17細(xì)胞比例FACS結(jié)果Fig.3 FACS results of Th17 frequencies in three groups

圖4 三組患者外周血 T-bet、GATA3和 RORγ t mRNA表達(dá)的比較Fig.4 Expression of T-bet,GATA3 and ROR γ t mRNA in three groups

圖5 三組患者血漿IFN-γ、IL-4和IL-17水平的比較Fig.5 The levels of IFN-γ,IL-4 and IL-17 in three groups

2.4 三組患者血漿IFN-γ、IL-4和IL-17水平的比較與對(duì)照組和EH組相比較,CA組IFN-γ和IL-17水平顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.01),而IL-4水平差別無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。對(duì)照組和EH組兩組間IFN-γ、IL-4和IL-17水平均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見圖5。

3 討論

在冠心病患者和AS易感動(dòng)物斑塊與循環(huán)中有大量活化的CD4+T淋巴細(xì)胞,它們與分泌的細(xì)胞因子組成了一個(gè)錯(cuò)綜復(fù)雜而又龐大的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng),促進(jìn)了斑塊的形成、成熟以及破裂,導(dǎo)致臨床心血管事件的發(fā)生[5]。隨著研究的深入,人們發(fā)現(xiàn)CD4+T細(xì)胞并不都是促AS的。CD4+T細(xì)胞由諸多不均一性的細(xì)胞亞群組成,大致可分為效應(yīng)性T細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。根據(jù)分泌細(xì)胞因子不同,將活化的效應(yīng)性T細(xì)胞又可分為Th1、Th2和Th17等亞群[6]。

Th1型免疫反應(yīng)是一種公認(rèn)的致AS的免疫反應(yīng)。無論是冠心病患者還是AS動(dòng)物模型,循環(huán)中均表現(xiàn)為Th1細(xì)胞比例和Th1型細(xì)胞因子顯著升高,斑塊局部浸潤的CD4+T細(xì)胞也多為Th1細(xì)胞,斑塊中大量表達(dá)Th1型細(xì)胞因子如 IFN-γ、TNF-α和TNF-β等和誘導(dǎo)Th1細(xì)胞活化的細(xì)胞因子如IL-12和IL-18等。Th1型免疫反應(yīng)不僅與AS的發(fā)生發(fā)展有關(guān),還與斑塊的不穩(wěn)定、急性冠脈綜合征臨床癥狀的出現(xiàn)密切相關(guān)。急性心肌梗死患者的Th1型優(yōu)勢反應(yīng)持續(xù)存在,往往提示患者預(yù)后不佳、易于發(fā)生心力衰竭。Th2型免疫反應(yīng)曾被認(rèn)為具有抗AS的作用。早先,Davenport等[7]發(fā)現(xiàn)IL-4缺失小鼠斑塊面積居然較對(duì)照組小,提示Th2型免疫反應(yīng)可能具有促AS的效應(yīng)。最近,King等[8]發(fā)現(xiàn)無論是給予外源性的IL-4還是敲除IL-4,均對(duì)不同性別、年齡、飲食方式甚至給予外源性AngⅡ的小鼠的AS病變無任何影響。隨著調(diào)節(jié)性T細(xì)胞負(fù)向調(diào)節(jié)AS的作用被證實(shí)之后,更多的研究者傾向于持Th2在AS中的作用待定的觀點(diǎn)。但是基于冠心病人群和正常人群Th2細(xì)胞活性幾無變化的特點(diǎn),Th2細(xì)胞很可能在AS的發(fā)生發(fā)展過程中充當(dāng)了旁觀者的角色。

本研究最值得關(guān)注的是,我們發(fā)現(xiàn)高血壓合并頸動(dòng)脈粥樣硬化患者Th17細(xì)胞的活性顯著升高,表現(xiàn)為Th17細(xì)胞比例是對(duì)照的兩倍多、關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子RORγ tmRNA表達(dá)顯著增多、特征細(xì)胞因子IL-17水平明顯升高強(qiáng)烈提示Th17細(xì)胞的活化參與了高血壓患者AS的發(fā)生發(fā)展過程。Th17細(xì)胞是遲至2005年才被發(fā)現(xiàn)的一型CD4+效應(yīng)性T細(xì)胞,介導(dǎo)了慢性炎癥性疾病、自身免疫性疾病、移植物排斥和腫瘤等疾病的發(fā)生。我們課題小組曾發(fā)現(xiàn)急性冠脈綜合癥的患者外周血中IL-17水平高于穩(wěn)定型心絞痛患者和對(duì)照組,并指出IL-17系Th17細(xì)胞分泌因子[9]。隨后,我們觀察到高血壓合并早期腎功能損害患者IL-17水平顯著升高,且與血漿AngⅡ水平正相關(guān),我們推測Th17細(xì)胞功能的上調(diào)與早期腎功能損害的出現(xiàn)有關(guān)[4]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,IL-17受體缺失或輸入抗IL-17中和性抗體小鼠的AS病變明顯減輕,這證實(shí)IL-17具有促AS的效應(yīng)[10,11]。最近,Madhur等[12]采用微泵緩釋AngⅡ的方法建立高血壓模型,發(fā)現(xiàn)AngⅡ可顯著增加脾臟T細(xì)胞分泌IL-17和促進(jìn)主動(dòng)脈壁內(nèi)IL-17mRNA的表達(dá)。若敲除小鼠的IL-17,血壓水平遠(yuǎn)低于對(duì)照組,血管炎癥也受到抑制,浸潤T細(xì)胞數(shù)目顯著減少。隨后,研究者檢測了糖尿病患者血漿IL-17水平。他們發(fā)現(xiàn)與血壓正常的患者相較,合并高血壓的糖尿病患者IL-17水平顯著升高。研究者指出,IL-17在AngⅡ介導(dǎo)的高血壓和血管功能紊亂中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

綜上所述,本研究初步揭示效應(yīng)性T細(xì)胞不同亞群功能的紊亂可能在高血壓患者AS發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用,主要表現(xiàn)為Th1、Th17功能的亢進(jìn)。對(duì)高血壓患者免疫調(diào)節(jié)紊亂的深入研究不僅有助于闡明高血壓患者出現(xiàn)AS損害的機(jī)制,而且可能為高血壓患者AS的防治尋找新的干預(yù)靶點(diǎn)。

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