王旭林，王紅梅，金曉燕，牟永華，梁 勇

甲狀腺乳頭狀癌中磷酸化蛋白激酶B和PTEN蛋白的表達(dá)及意義

王旭林，王紅梅，金曉燕，牟永華，梁 勇

目的 分析磷酸化蛋白激酶B(p－AKT)和PTEN蛋白在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)及意義。方法 應(yīng)用免疫組化PV－6001/6002兩步法檢測40例甲狀腺乳頭狀癌手術(shù)切除標(biāo)本和20例癌旁正常甲狀腺組織中p－AKT和PTEN蛋白的表達(dá)，分析二者與臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果 p－AKT蛋白在甲狀腺乳頭狀癌中陽性表達(dá)率顯著高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.01);而PTEN蛋白在甲狀腺乳頭狀癌中陽性表達(dá)率顯著低于癌旁正常組織的陽性表達(dá)率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.01)。不同臨床TNM分期、有無漿膜浸潤、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，癌組織中p－AKT和PTEN蛋白的陽性表達(dá)率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05);而不同年齡、腫瘤直徑的患者，癌組織中二者的陽性表達(dá)率間差異無統(tǒng)計學(xué)差異 (P＞0.05)。p－AKT與PTEN蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān) (r=－0.325，P＜0.05)。結(jié)論 p－AKT和PTEN蛋白的表達(dá)改變與甲狀腺乳頭狀癌的形成有一定關(guān)系;二者表達(dá)狀況的檢測對判斷甲狀腺乳頭狀癌的惡性程度及預(yù)后具有重要的臨床意義。

甲狀腺腫瘤;磷酸化蛋白激酶B;PTEN;免疫組織化學(xué);腫瘤轉(zhuǎn)移

甲狀腺癌占人類全部惡性腫瘤的1%，發(fā)病率呈上升趨勢。病理分型中乳頭狀癌最為多見，早期甲狀腺乳頭狀癌以手術(shù)為主的治療效果較好，10年生存率可達(dá)80%左右［1］，但仍有部分患者存在復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，影響預(yù)后。甲狀腺癌的發(fā)病機制仍不清楚，缺少一種理想的生物指標(biāo)評估其惡性程度、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后。本研究通過免疫組化法分析甲狀腺乳頭狀癌Ⅰ型磷脂酰肌醇3－激酶 (PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信號通路和PTEN蛋白的表達(dá)，探索其臨床病理意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取臺州學(xué)院醫(yī)學(xué)院附屬市立醫(yī)院2006—2009年甲狀腺乳頭狀癌切除標(biāo)本40例，患者術(shù)前均未經(jīng)過放療和化療，所有標(biāo)本經(jīng)病理確診。其中女28例，男12例;年齡32～78歲，中位年齡50歲;微小癌7例，非微小癌33例;臨床TNM分期:Ⅰ、Ⅱ期21例，Ⅲ、Ⅳ期19例;有漿膜浸潤者17例，無漿膜浸潤23例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者19例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者21例。同時選癌旁正常甲狀腺組織20例，常規(guī)病理切片證實。

1.2 試劑 兔抗人p－AKT多克隆抗體 (1∶500，美國 Cell Signaling公司)，濃縮型兔抗人PTEN蛋白多克隆抗體 (1∶800，美國Abicam公司);PV－6001/6002檢測試劑盒及DAB顯色試劑盒均購于北京中山生物技術(shù)公司。

1.3 方法 所選40例甲狀腺癌組織標(biāo)本和20例甲狀腺癌旁正常組織分別標(biāo)記，常規(guī)石蠟包埋、切片，分別檢測p－AKT和PTEN蛋白陽性表達(dá)。采用PV－6001/6002二步法免疫組化方法檢測相應(yīng)抗體抗原。所有實驗操作按照實驗說明書步驟嚴(yán)格進(jìn)行。用已知陽性的乳腺癌切片作為陽性對照，PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照。

1.4 結(jié)果判定 p－AKT蛋白陽性染色以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為標(biāo)準(zhǔn)，甲狀腺正常組織和乳頭狀癌組織p－AKT蛋白表達(dá)免疫組化圖見圖1、圖2;PTEN蛋白陽性染色主要定位于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核中，染色為棕黃色細(xì)顆粒狀，甲狀腺正常組織和乳頭狀癌組織PTEN蛋白表達(dá)免疫組化圖見圖3、圖4。免疫組化結(jié)果由兩位以上病理醫(yī)師采用雙盲法觀察每張切片。陽性細(xì)胞計數(shù)按照Lee等［2］評判標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。每例標(biāo)本觀察10個高倍視野 (×400)，計數(shù)1 000個細(xì)胞，無著色或陽性細(xì)胞百分率＜30%為陰性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。各組間比較應(yīng)用Pearson Chi－square Test，F(xiàn)isher'Exact Test，α=0.05。分析 p－AKT和 PTEN蛋白兩指標(biāo)間關(guān)系采用Spearman秩相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 甲狀腺乳頭狀癌組織中p－AKT、PTEN蛋白陽性表達(dá)率均顯著高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.01，見表1)。

2.2 p－AKT和PTEN蛋白表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理特征的關(guān)系 p－AKT、PTEN蛋白的表達(dá)在TNM分期、漿膜浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05);而在不同年齡、腫瘤直徑分組間的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05，見表2)。

2.3 相關(guān)性檢驗 40例甲狀腺乳頭狀癌中p－AKT和PTEN蛋白同時表達(dá)陽性的例數(shù)為12例，同時表達(dá)陰性的例數(shù)4例，p－AKT表達(dá)陽性而PTEN表達(dá)陰性者14例，p－AKT表達(dá)陰性而PTEN表達(dá)陽性者10例。Spearman相關(guān)分析顯示，兩者在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān) (r=－0.325，P＜0.05)。

表1 甲狀腺乳頭狀癌及癌旁正常組織中p－AKT和PTEN蛋白的表達(dá)Table 1 Expression of p－AKT and PTEN protein in papillary thyroid carcinoma and normal tissues

圖1 p－AKT蛋白在甲狀腺正常組織的陽性表達(dá)，PV－6001/6002二步法 (×400)Figure 1 Positive expression of p－AKT protein in thyroid normal tissues(×400)圖2 p－AKT蛋白在甲狀腺乳頭狀癌組織的陽性表達(dá)，PV－6001/6002二步法 (×400)Figure 2 Positive expression of p－AKT protein in papillary thyroid carcinoma(×400)圖3 PTEN蛋白在甲狀腺正常組織的陽性表達(dá)，PV－6001/6002二步法 (×400)Figure 3 Positive expression of PTEN protein in thyroid normal tissues(×400)圖4 PTEN蛋白在甲狀腺乳頭狀癌組織的陽性表達(dá)，PV－6001/6002二步法 (×400)Figure 4 Positive expression of PTEN protein in papillary thyroid carcinoma(×400)

表2 p－AKT和PTEN蛋白表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理特征的關(guān)系Table 2 Expression of p－AKT and PTEN protein in papillary thyroid carcinoma and its relationship to clinicopathological features

3 討論

PI3K/AKT信號通路參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、凋亡與分化等生理過程，能被細(xì)胞表面受體活化的PI3K、受體酪氨酸激酶和非受體酪氨酸激酶活化，在細(xì)胞膜上生成磷脂酰肌醇－3，4，5－磷酸 ［phosph atidylinositol(3，4，5) －trisphosphate，PIP3］，作為細(xì)胞第二信使與細(xì)胞內(nèi)磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(PDK1)和信號蛋白分子AKT(也稱為蛋白激酶B)結(jié)合，從而活化AKT。促使AKT從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜以及構(gòu)象改變，Ser473和Thr308位點發(fā)生磷酸化而被激活?；罨腁KT再進(jìn)一步激活其下游因子，如Bcl－2家族、E2F、糖原合成酶激酶3(glycogen synthase kinase 3，GSK3)、S6蛋白激酶等，對細(xì)胞增殖、凋亡和血管生成等進(jìn)行調(diào)節(jié)［3］。

PTEN可拮抗PI3K/Akt通路，催化PIP3去磷酸化生成磷脂酰肌醇 －4，5－磷酸 (phosphatidylinositol－4，5－biphosphate，PIP2)，從而直接拮抗PI3K的活性，實現(xiàn)對PI3K/Akt通路的負(fù)調(diào)控，滅活多種凋亡效應(yīng)分子、調(diào)控細(xì)胞周期、激活端粒酶活性、促進(jìn)血管生成和遷移相關(guān)程序等途徑而促進(jìn)腫瘤的生長和侵襲。在多種腫瘤組織中均檢測到PTEN的缺失或突變，同時PI3K信號通路則相應(yīng)顯現(xiàn)高活性［4－7］。

目前，有關(guān)甲狀腺乳頭狀癌組織中p－AKT蛋白的表達(dá)情況報道較少，且意義尚不清楚。本實驗應(yīng)用免疫組化方法檢測40例甲狀腺乳頭狀癌組織中p－AKT蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示p－AKT蛋白在甲狀腺乳頭狀癌組織中的陽性表達(dá)率顯著高于癌旁正常組織，提示p－AKT蛋白可能在甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生發(fā)展中有重要作用。Erika等［8］應(yīng)用免疫組化EnVision法檢測腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤組織和癌旁正常組織中的p－AKT的表達(dá)水平，結(jié)果顯示腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤組織中p－AKT蛋白表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，與本研究結(jié)果一致。Benelli等［9］研究發(fā)現(xiàn)人類前列腺癌組織中p－AKT表達(dá)增多，活化的AKT通過促進(jìn)細(xì)胞增殖并抑制其凋亡從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展;研究還發(fā)現(xiàn)AKT的活化程度與腫瘤的臨床過程和病理學(xué)進(jìn)展有關(guān)，如侵襲范圍、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分期等。本實驗結(jié)果顯示:TNMⅢ、Ⅳ期的甲狀腺乳頭狀癌組織中p－AKT蛋白的陽性表達(dá)率顯著高于TNMⅠ、Ⅱ期;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的甲狀腺乳頭狀癌組織中p－AKT蛋白陽性表達(dá)率顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者;有漿膜浸潤的甲狀腺乳頭狀癌組織中p－AKT蛋白陽性表達(dá)率顯著高于無漿膜浸潤者。推測p－AKT參與了甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移，p－AKT的高表達(dá)提示甲狀腺乳頭狀癌患者的預(yù)后較差。p－AKT有可能成為甲狀腺乳頭狀癌復(fù)發(fā)風(fēng)險及判斷預(yù)后的重要生物學(xué)指標(biāo)。

PTEN作為抑癌基因家族新成員，是繼p53后在人類腫瘤中發(fā)現(xiàn)缺失和突變率最高的抑癌基因之一，定位于染色體10q23.3位點［10］。研究表明，大多數(shù)腫瘤中均存在PTEN缺失和突變源。Wang等［11］應(yīng)用免疫組化方法檢測了成骨肉瘤及肉瘤旁組織中PTEN mRNA和蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)PTEN mRNA在成骨肉瘤組織內(nèi)的表達(dá)水平顯著低于相應(yīng)的肉瘤旁組織，在成骨肉瘤組織內(nèi)PTEN mRNA表達(dá)水平與肉瘤旁組織的惡性程度分級、TNM分期、有無轉(zhuǎn)移等進(jìn)行組間比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。本實驗在甲狀腺乳頭狀癌中也得到了類似的結(jié)果，PTEN蛋白在癌旁正常組織中陽性表達(dá)率與甲狀腺乳頭狀癌組織比較有顯著差異，提示PTEN的表達(dá)下調(diào)可能與甲狀腺乳頭狀癌的惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。分析PTEN與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理特征的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，PTEN表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌的TNM分期、漿膜浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。漿膜浸潤程度越深，PTEN蛋白表達(dá)的陽性率越低;伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，PTEN蛋白表達(dá)的陽性率較無轉(zhuǎn)移者顯著降低;TNM分期Ⅲ、Ⅳ期甲狀腺乳頭狀癌組織PTEN蛋白表達(dá)水平顯著低于Ⅰ、Ⅱ期甲狀腺乳頭狀癌組織，提示PTEN蛋白的表達(dá)下調(diào)可能與甲狀腺乳頭狀癌的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。這一研究結(jié)果與國內(nèi)外大多數(shù)學(xué)者的研究結(jié)果一致。表明PTEN蛋白表達(dá)的下調(diào)可能是甲狀腺腫瘤發(fā)生的始動因素之一，且與甲狀腺乳頭狀癌的生物學(xué)行為和預(yù)后密切相關(guān)。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在甲狀腺乳頭狀癌組織中p－AKT和PTEN蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，分析甲狀腺乳頭狀癌中p－AKT異常激活可能與PTEN蛋白的表達(dá)缺失有著密切的關(guān)系。PTEN不僅具有抑癌基因的特性，而且還表現(xiàn)有磷酸酶活性，是一個具有磷酸酯酶活性的抑癌基因。其作用主要是通過PI3K/AKT信號通路來實現(xiàn)的，在該信號通路中，PTEN蛋白對PI3K/AKT通路起著負(fù)調(diào)控作用。PI3K通過磷酸化PIP2使PI3K/AKT通路活化，而PTEN卻通過脫磷酸化作用而負(fù)性調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路，PTEN的突變或丟失，使細(xì)胞內(nèi)PIP3積聚，AKT持續(xù)活化，從而抑制細(xì)胞凋亡，刺激細(xì)胞持續(xù)生長，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生［12］。值得注意的是，p－AKT和PTEN蛋白在甲狀腺乳頭狀癌組織中共同呈陽性表達(dá)為12例，這可能是由于甲狀腺乳頭狀癌組織中還存在p－AKT的其他調(diào)控途徑，也可能是由于PTEN為突變型，雖然有蛋白表達(dá)，但所編碼的蛋白已失去正常下調(diào)p－AKT的功能。國外研究表明，不同腫瘤組織中，細(xì)胞內(nèi)PDK1/AKT激活方式不同。部分報道與PTEN基因的高度缺失、突變、甲基化等及PTEN蛋白功能缺失有關(guān)，有些則可能是受到其他調(diào)控，AKT自身過度表達(dá)所致［13］。本研究結(jié)果表明甲狀腺乳頭狀癌組織中存在著p－AKT的過表達(dá)和PTEN表達(dá)缺失，提示p－AKT和PTEN蛋白共同參與甲狀腺乳頭狀癌的演變過程。

本研究提示:p－AKT和PTEN蛋白的表達(dá)在甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮著重要作用。臨床上檢測二者的表達(dá)有助于甲狀腺乳頭狀癌的治療及判斷預(yù)后，并為甲狀腺癌生物學(xué)分子靶向治療奠定理論基礎(chǔ)。關(guān)于二者在甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生、發(fā)展過程中的分子生物學(xué)機制尚待進(jìn)一步研究。

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The Expression and Role of p－AKT and PTEN Protein in Human Papillary Thyroid Carcinoma

WANG Xu－lin，WANG Hong － mei，JIN Xiao － yan，et al.Taizhou Municipal Hospital，Affiliated to Medical College of Taizhou University，Taizhou 318000，China

ObjectiveTo investigate the expression and role of p－AKT and PTEN protein and their clinicopathological significance in human papillary thyroid carcinoma.MethodsThe expression of p－AKT and PTEN protein was detected in 40 cases of papillary thyroid carcinoma and 20 cases of normal tissues by PV－6001/6002 two－step immunohistochemistry.The correlations between p－AKT and PTEN protein expression，and the relationship between their expressions and the clinicopathological features were analyzed.ResultsThe expression of p－AKT in papillary thyroid carcinoma was significantly higher than that in normal tissues(P＜0.01)，while the expression of PTEN protein in papillary thyroid carcinoma was significantly lower than that in normal tissues(P＜0.01).Expression of p－AKT and PTEN protein showed significant difference with different TNM stage，serous membrane invasion and lymph node metastasis(P＜0.05).Expression of p－AKT and PTEN protein showed no significant difference with different patients'age and different carcinoma diameter(P＞0.05).The expression of p－AKT was negatively correlated with the expression of PTEN protein(r= －0.325，P＜0.05).ConclusionThe expression of p－AKT and PTEN may be correlated with the carcinogenesis and development of thyroid carcinoma.Detecting the expression of p－AKT and PTEN protein would be of great clinical significance to evaluate malignant degree and prognosis of papillary thyroid carcinoma.

Thyroid neoplasms;p－AKT;PTEN;Immunohistochemisty;Neoplasm metastasis

R 736.1

A

1007－9572(2011)12－4163－04

國家自然科學(xué)基金項目 (81072209/H1625);臺州市科技計劃項目 (100ky－26)

318000浙江省臺州市，臺州學(xué)院醫(yī)學(xué)院附屬市立醫(yī)院 (王旭林，金曉燕，牟永華，梁勇);臺州學(xué)院醫(yī)學(xué)院 (王紅梅)

梁勇，318000浙江省臺州市，臺州學(xué)院醫(yī)學(xué)院附屬市立醫(yī)院;E－mail:liangy@yahoo.cn

2011－08－10;

2011－11－09)

(本文編輯:劉莉)