元建華，彭大為，李建旺，王美清

晚期結(jié)直腸癌患者樹突細胞聯(lián)合細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞治療效果研究

元建華，彭大為，李建旺，王美清

目的 探討樹突細胞 (DC)聯(lián)合細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞 (CIK)治療晚期結(jié)直腸癌患者的臨床療效。方法 將40例臨床確診的晚期結(jié)直腸癌患者隨機分為兩組，觀察組給予免疫治療聯(lián)合化療，對照組僅給予化療。觀察兩組患者治療前后細胞免疫指標 (CD3+、CD4+、CD8+細胞比例及CD4+/CD8+)變化、卡氏評分 (Karnofsky，KPS評分)和療效，并觀察其不良反應(yīng)。結(jié)果 觀察組患者治療后CD3+細胞的比例較治療前顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P=0.001);而CD4+、CD8+細胞的比例及CD4+/CD8+治療前后比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05)。對照組免疫學(xué)指標 (CD3+、CD4+、CD8+細胞的比例及CD4+/CD8+)治療前后比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05)。觀察組患者治療后有效率為45%，對照組有效率為35%，兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05);觀察組KPS評分總提高率為80%，對照組為60%，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05)。結(jié)論 DC聯(lián)合CIK治療可明顯改善晚期結(jié)直腸癌患者外周血淋巴細胞亞群水平，能提高患者的生活質(zhì)量。

樹突細胞;細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞;結(jié)直腸腫瘤;免疫治療

結(jié)直腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，占所有腫瘤患者的10% ～15%［1］。隨著國內(nèi)生活水平的提高，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢，男女性結(jié)直腸癌發(fā)病率均位居第三。盡管有40%～50%的結(jié)直腸癌患者可通過手術(shù)治愈，但至少20%的患者診斷時已發(fā)生轉(zhuǎn)移，而晚期轉(zhuǎn)移患者的5年生存率低于10%［1］。因此，探索新的結(jié)直腸癌治療手段、以樹突細胞 (dendritic cells，DC)和細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞 (cytokine－induced killers，CIK)為基礎(chǔ)的腫瘤細胞免疫治療成為目前研究的熱點之一。多項研究表明DC與CIK具有協(xié)同作用，共同孵育后DC共刺激分子的表達及抗原遞呈能力均可提高，且CIK的增殖能力和細胞毒性也進一步增強［2－3］。目前DC聯(lián)合CIK治療多應(yīng)用于血液系統(tǒng)腫瘤患者，用于晚期結(jié)直腸癌的治療報道很少。本研究采用DC聯(lián)合CIK治療40例晚期結(jié)直腸癌患者，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2010年1月—2011年3月我院腫瘤科收治的42例晚期結(jié)直腸癌患者，均經(jīng)病理組織學(xué)或細胞學(xué)檢查確診為晚期結(jié)直腸癌平均至少有一處可測量病灶，其中結(jié)腸癌26例、直腸癌16例;男31例，女11例;腺癌37例，黏液腺癌4例，印戒細胞癌1例;初治10例，復(fù)治32例;所有患者卡氏評分 (Karnofsky，KPS評分)≥60分，預(yù)計生存期≥3個月，1個月內(nèi)未接受過其他任何抗腫瘤治療。

采用隨機數(shù)字法將42例患者分為兩組。觀察組21例，男15例，女6例;年齡46～78歲，中位年齡60歲;16例復(fù)治。對照組21例，男16例，女5例;年齡45～76歲，中位年齡58歲;14例復(fù)治。

1.2 方法 對照組患者僅給予單純化療，觀察組患者給予DC－CIK聯(lián)合化療，回輸按照下述的途徑來進行:包括4次靜脈CIK、4次靜脈DC輸注及相關(guān)的臨床觀察和檢測程序，回輸時間12～14 d。

1.2.1 細胞分離 觀察組21例患者經(jīng)CS－3000血細胞分離機采集患者自身外周血單個核細胞 (peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，再用聚蔗糖400(Fieoll 400，中國科學(xué)院生物物理研究所)分離后經(jīng)磷酸鹽緩沖液 (PBS)液洗3次，收集純度在90%以上的PBMC。

1.2.2 DC細胞的體外培養(yǎng)和擴增 將CS－3000分離得到的PBMC，每次采集細胞總數(shù)在為 (1.6～4.6) ×109，PBMC用pH 7.4的PBS洗滌3次，將細胞按2×106/ml數(shù)量懸浮于RPMI－1640完全培養(yǎng)基 (內(nèi)含10%胎牛血清和5%AB血清)，培養(yǎng)2 h，棄上清，獲得貼壁的PBMC，向每孔加入完全培養(yǎng)基［含200 μg/L粒細胞－單核細胞集落刺激因子 (rhGMCSF)和50 μg/L重組人白介素4(rhIL－4)］，每2 d半量換培養(yǎng)基，培養(yǎng)5 d［4］，觀察DC的形態(tài)和增殖情況，第7天加入干擾素γ(INF－γ)1 000 U/ml和腫瘤壞死因子α(TNF－α)200 μg/L，16 h后收集細胞進行細胞表面標志檢測和無菌檢驗合格后進行細胞回輸治療。

1.2.3 CIK細胞體外培養(yǎng)和擴增 PBMC經(jīng)pH 7.4的PBS洗滌3次，將細胞按2×106/ml數(shù)量懸浮于RPMI－1640完全培養(yǎng)基 (內(nèi)含10%胎牛血清和5%自身滅活血漿)并加入2 000 ml的細胞培養(yǎng)袋，加重組人干擾素 (rh－IFN)1 000 U/ml，24 h后加入抗 CD3單克隆抗體 (抗 CD3－MoAb)1 mg/L，rhIL －2 50 U/ml，IL －2 1 000 U/ml，CD3－ MoAb 50 μg/L，IL－1a 1 000 U/ml。此后每2 d半換液并計數(shù)，培養(yǎng)7 d后，經(jīng)細菌和霉菌培養(yǎng)陰性后再收集細胞，用無菌0.9%氯化鈉注射液洗3次，將細胞懸浮于自身血漿中，加入5×104U/L rhIL－2，用輸血器回輸給患者，2 h內(nèi)輸完。

1.2.4 細胞回輸 收集12～14 d的CIK細胞，每次回輸?shù)募毎婊盥蕬?yīng)＞95%，細胞總數(shù)＞1×1010個。600 r/min×10 min離心，洗滌2次后，細胞溶于0.9%氯化鈉注射液100 ml，細胞＞1010/ml，靜脈滴注，2 h內(nèi)回輸患者體內(nèi)。收集10～14 d的懸浮的經(jīng)過表型鑒定的成熟DC，細胞＞1×106/ml，溶于100 ml 0.9%氯化鈉注射液，靜脈滴注，2 h內(nèi)回輸患者體內(nèi)。

1.3 觀察指標 按WHO實體瘤的近期療效標準分為完全緩解 (CR)、部分緩解 (PR)、穩(wěn)定 (SD)、進展 (PD)4級。生活質(zhì)量變化:記錄患者癥狀及體征變化，用KPS計分法判斷治療前后的變化，凡在治療后較治療前記分提高10分以上者為改善;而下降10分以上者為惡化;提高或下降10分者為穩(wěn)定，總提高率為改善+穩(wěn)定［5］。治療結(jié)束后4周進行療效評價。

免疫學(xué)評價:治療結(jié)束后4周，評價兩組患者治療前后外周血中CD3+、CD4+、CD8+細胞比例及CD4+/CD8+的變化。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計檢驗。計量資料以(±s)表示，采用t檢驗;率的比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床療效 42例患者治療中1例失訪，1例因經(jīng)濟原因中途退出。治療后觀察組CR 0例，PR 9例，SD 6例，PD 5例，有效率 (CR+PR)45%;KPS評分提高7例，穩(wěn)定9例，惡化4例，總提高率為80%。對照組CR 0例，PR 7例，SD 6例，PD 7例，有效率35%;KPS評分提高4例，穩(wěn)定8例，惡化8例，總提高率為60%。兩組有效率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (χ2=2.87，P＞0.05);而兩組KPS評分總提高率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (χ2=7.26，P＜0.05)。

觀察組回輸過程中出現(xiàn)短暫發(fā)熱 (但＜38℃)2例，未予特殊治療好轉(zhuǎn)。

2.2 治療前后患者外周血淋巴細胞表型變化 觀察組患者經(jīng)DC聯(lián)合CIK治療后4周，外周血中CD3+細胞的比例較治療前顯著增加，亦較對照組治療后顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);對照組患者治療后外周血中CD3+、CD4+、CD+8細胞的比例及CD4+/CD8+與治療前比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05，見表1)。

表1 觀察組和對照組患者治療前后細胞免疫指標變化的比較(±s，%)Table 1 Changes of T cell subgroup in peripheral blood before and after treatment in two groups

表1 觀察組和對照組患者治療前后細胞免疫指標變化的比較(±s，%)Table 1 Changes of T cell subgroup in peripheral blood before and after treatment in two groups

注:與對照組治療后比較，*P＜0.05

組別 CD3+ CD4+ CD8+ CD4+/CD8+觀察組(n=20)治療前 54±10 30±6 29±5 1.61±0.65治療后 64± 7* 34±8 27±4 1.94±0.64 t 0.001 0.088 0.186 0.106對照組(n=20)4.029 1.797 1.373 1.697 P值值治療前 56±12 31±7 27±6 1.58±0.76治療后 54± 6 30±5 27±5 1.54±0.46 t 0.817 0.815 0.361 0.210 P值值0.420 0.425 0.722 0.836

3 討論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與機體的免疫功能有著密切的關(guān)系，因此，通過提高腫瘤組織對宿主的免疫源性和增強機體對腫瘤細胞的免疫應(yīng)答能力來抑制或消除腫瘤的免疫治療是抗腫瘤治療的重要方法之一，腫瘤免疫治療已被眾多學(xué)者認為是具有較大潛力的治療措施，它能較徹底地清除殘余的腫瘤細胞，是目前腫瘤綜合治療研究的熱點之一。

DC由美國學(xué)者Steinman等［6］于1973年發(fā)現(xiàn)，是目前已知體內(nèi)抗原遞呈能力最強的抗原遞呈細胞，它表面高水平表達的MHCⅠ類和Ⅱ類分子可有效提呈腫瘤抗原多肽，并高水平表達刺激分子CD80、CD86、CD40、CD50等共刺激分子，提供T細胞激活所必需的第二信號。DC與T細胞結(jié)合后，大量分泌IL－12，誘導(dǎo)Th1型應(yīng)答，有利于腫瘤細胞的清除［7－8］。根據(jù)DC的來源，可將其分為骨髓來源DC和類漿細胞DC兩類［9］。CIK又稱為NK細胞樣T淋巴細胞，是將人PBMC在體外經(jīng)過多種細胞因子 (IFN－γ、IL－2、抗CD3－MoAb、IL－1a等)共同誘導(dǎo)而獲得的一群異質(zhì)細胞，同時表達CD3和CD56兩種膜蛋白分子［10］，兼具有T淋巴細胞強大的抗瘤活性和NK細胞的非MHC限制殺瘤特點。大量研究表明，DC與CIK細胞共培養(yǎng)后可促進 DC 和 CIK 細胞成熟［2－3，11］。

Burgdorf等［12］提取直腸癌患者的PBMC，經(jīng)含有腫瘤細胞表面抗原的腫瘤細胞裂解物反復(fù)沖擊，從而致敏DC形成疫苗。17例直腸癌患者每人2周注射1次疫苗，共注射10次，結(jié)果顯示SD 4例。吳艷峰等［13］進行的一項用抗原致敏的DC治療晚期大腸癌患者的臨床研究，結(jié)果顯示觀察組的有效率為44.83%，對照組的有效率為22.58%。李敏等［14］應(yīng)用凋亡小鼠B細胞淋巴瘤細胞A20負載的DC來制備凋亡腫瘤細胞負載的DC(AP－DC)，A20荷瘤小鼠分別被注射AP－DC、2A單抗或二者聯(lián)合。結(jié)果表明單獨注射AP－DC和2A單抗的有效率分別為12.5%和5.0%;二者聯(lián)合的有效率為62.5%，并且荷瘤鼠可長期生存。

本研究結(jié)果顯示，DC聯(lián)合CIK治療后晚期結(jié)直腸癌患者的細胞免疫學(xué)指標 (CD3+細胞比例)較治療前顯著提高，提示DC聯(lián)合CIK治療后患者細胞免疫能力明顯增強。而對照組患者在化療前后細胞免疫指標無顯著變化，說明患者的免疫狀態(tài)和水平無明顯改善。此外，觀察組患者治療后CD3+細胞比例顯著高于對照組，說明了觀察組相對于對照組而言，在提升患者免疫水平方面有明顯的優(yōu)勢。按WHO實體瘤的近期療效標準，觀察組治療后有效率45%，對照組有效率35%，兩組療效間無顯著差異;觀察組KPS評分總提高率為80%，對照組KPS評分總提高率為60%，兩組間有顯著差異。提示DC聯(lián)合CIK治療與單純化療比較，患者的生活質(zhì)量明顯改善，療效上有提高的趨勢，為免疫治療可能在晚期結(jié)直腸癌患者的治療方面發(fā)揮更大的作用提供部分臨床資料或依據(jù)。由于本研究隨訪時間短，目前多數(shù)患者病情穩(wěn)定，仍需隨訪其遠期療效及對患者生存期的影響。

綜上所述，DC聯(lián)合CIK能明顯提高晚期結(jié)直腸癌患者的免疫功能，改善臨床癥狀，提高患者的生存質(zhì)量，并有改善患者療效的趨勢，為晚期結(jié)直腸癌患者提供了新的治療手段。

1 Jemal A，Murray T，Ward E，et al.Cancer statistics［J］.CA Cancer J Clin，2005，55(1):10－30.

2 Marten A，Ziske C，Schottker B，et al.Interactions between dendritic cells and cytokine－induced killer cells lead to an activation of both population ［J］.J Immunother，2001，24(6):502－510.

3 Marten A，Renoth S，von Liolienfeld－Toal M，et al.Enhanced lytic activity of cytokine－induced killer cells against multiple myeloma cells after co－culture with idiotype－pulsed dendritic cells［J］.Haematologica，200l，86(10):1029 －1037.

4 田復(fù)明，竇長武，高乃康，等.外周血樹突狀細胞的制備和表型分析 ［J］.中國誤診學(xué)雜志，2009，9(15):3573.

5 鄧笑偉，徐銘寶，高錦，等.不同來源CIK與DC細胞聯(lián)合治療中晚期肺癌的臨床研究 ［J］.科技導(dǎo)報，2008，26(11):35－38.

6 Steinman RM，Cohn ZA.Identification of novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice:morphology，quantification，tissue distribution ［J］.J Exp Med，1973，137(5):1142－1162.

7 Schmidt－Wolf I，Negrin R，Kiem H，et al.Usc of a SCID mouse/human lymphoma model to evaluate eytokine－induced killer cells with potent antitumor cell activity［J］.J Exp Med，1991，174:139.

8 李穎超，張觀宇，許立莉.CD105和VEGF在大腸癌中的表達及意義［J］.中國誤診學(xué)雜志，2010，10(36):8878.

9 Wurzenberger C，Koelzer VH，Schreiber S，et al.Short－term activation induces multifunctional dendritic cells that generate potent antitumor T－cell responses in vivo［J］.Cancer Immunol Immunother，2009，58(6):901－913.

10 Marten A，Schottker B，Ziske C，et al.Increase of the immunostimulatory effect of dendritic cells by pulsing with CA19－9 protein［J］.J Immunother，2000，23:464 －472.

11 張嵩，王恩忠，白春學(xué)，等.共培養(yǎng)的樹突狀細胞與CIK細胞治療結(jié)腸癌血源性肺轉(zhuǎn)移的實驗研究 ［J］.腫瘤，2003，23(6):448－451.

12 Burgdorf SK，F(xiàn)ischer A，Myschetzky PS，et al.Clinical responses in patients with advanced colorectal cancer to a dendritic cell based vaccine［J］.Oncol Rep，2008，20(6):1305－1311.

13 吳艷峰，萬濤，陳國友，等.化療為基礎(chǔ)的樹突狀細胞疫苗治療大腸癌的免疫學(xué)機制的研究［］.中國免疫學(xué)會第五屆全國代表大會暨學(xué)術(shù)會議，2006:398－399.

14 李敏，陳成，古濤，等.激發(fā)型4－1BB單抗聯(lián)合凋亡腫瘤細胞負載的樹突狀細胞在惡性腫瘤免疫治療中的作用 ［J］.中國免疫學(xué)雜志，2006，22(7):640－649.

Clinical Research of Dendritic Cells Combined with Cytokine Induced Killer Cells Therapy for Advanced Colorectal Cancer

YUAN Jian－h(huán)ua，PENG Da－wei，LI Jian－wang，et al.Haikou Municipal Hospital，Haikou 570208，China

ObjectiveTo evaluate clinical effects of dendritic cells(DC)combined with cytokine induced killer cells(CIK)therapy for advanced colorectal cancer.MethodsForty advanced colorectal cancer patients were randomly divided into treatment group and control group.The treatment group was given immunotherapy combined with chemotherapy.The treatment group was also given DC and CIK at an interval of 10～14 days after chemotherapy.The control group was only given chemotherapy.T lymphocyte subtypes in peripheral blood of two groups(CD3+，CD4+，CD8+，CD4+/CD8+)were analyzed before and after treatment.Performance Status(KPS)，clinical effects and side effects were observed.ResultsThe level of CD3+showed significant difference before and after treatment in the treatment group(P=0.001)，while the levels of CD4+，CD8+，CD4+/CD8+showed no significant difference before and after treatment(P＞0.05).The levels of CD3+，CD4+，CD8+，CD4+/CD8+showed no significant difference before and after treatment in the control group(P＞0.05).The effective rate in treatment group and control group was 45%and 35%respectively(P＞0.05);The effective rate of KPS in treatment group and control group was 80%and 60%respectively，the difference was statistically significant(P ＜0.05).ConclusionDC combined with CIK therapy can improve T lymphocyte subtypes in peripheral blood of advanced colorectal cancer patients，and it can also improve thelife quality of patients.

Dendritic cells;Cytokine induced killer cells;Colorectal neoplasms;Immunotherapy

R 735.34

A

1007－9572(2011)12－4139－03

570208海南省?？谑腥嗣襻t(yī)院腫瘤科

彭大為，570208海南省?？谑腥嗣襻t(yī)院;

E－mail:yuan200908@sina.com

2011－06－12;

2011－11－13)

(本文編輯:劉莉)