張 橋, 鄢國(guó)平，程巳雪

(1．武漢工程大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430074；2．武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院生物醫(yī)用高分子材料教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430072)

0 引 言

海藻酸鈉(alginate)是一種天然多糖，具有很好的生物相容性，被廣泛用于食品和醫(yī)用領(lǐng)域.海藻酸是由古洛糖醛酸(G單元)和甘露糖醛酸(M單元)兩種結(jié)構(gòu)單元組成的線性嵌段共聚物，其中G單元可以與鈣、銅、鋅等二價(jià)離子螯合，在溫和的條件下迅速形成水凝膠.由于形成的水凝膠無(wú)毒無(wú)害，被廣泛應(yīng)用于藥物載體、組織工程支架、細(xì)胞微膠囊化等領(lǐng)域[1-2].但是離子交聯(lián)的海藻酸鈉水凝膠放置一段時(shí)間后機(jī)械強(qiáng)度會(huì)逐漸下降，這可能是因?yàn)榻宦?lián)的離子會(huì)擴(kuò)散到周?chē)娜芤褐校瑥亩顾z的交聯(lián)密度下降.用雙功能團(tuán)的交聯(lián)劑共價(jià)交聯(lián)海藻酸鈉可以得到更為穩(wěn)定海藻酸鈉水凝膠[3].例如先用高碘酸鈉氧化海藻酸鈉，然后用己二酸二酰肼交聯(lián)，可得到機(jī)械強(qiáng)度較高的水凝膠[4].但是用普通化學(xué)交聯(lián)需要在較苛刻的條件下反應(yīng)，并可能引入有害的催化劑，降低海藻酸鈉水凝膠的生物相容性.

點(diǎn)擊化學(xué)是一類(lèi)選擇性高、反應(yīng)速率快、產(chǎn)率高的化學(xué)反應(yīng).由于它反應(yīng)條件溫和，基本沒(méi)有副產(chǎn)物，已經(jīng)廣泛用于藥物開(kāi)發(fā)和生物醫(yī)用高分子材料的制備[5-7].用點(diǎn)擊化學(xué)制備的高分子材料具有較好的強(qiáng)度和生物相容性.有研究報(bào)道，細(xì)胞可以在用“點(diǎn)擊”化學(xué)制備的透明質(zhì)酸水凝膠內(nèi)生長(zhǎng)[8].本研究合成了疊氮化和炔基化的海藻酸鈉，再利用疊氮基和炔基之間的環(huán)加成點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)制備海藻酸鈉水凝膠，該水凝膠具有較大的孔徑和pH敏感性.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

海藻酸鈉(Mw=2.85×105)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)，丙炔胺購(gòu)自Sigma，乙醇胺使用前減壓蒸餾.N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán), 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)購(gòu)自上海寶曼生物試劑有限公司, 2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)緩沖鹽購(gòu)自Amresco, 其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?

1.2 海藻酸鈉水凝膠的制備

1.2.1 疊氮基和炔基海藻酸鈉的合成 在10 ℃ 將30.5 g 40% 溴化氫緩慢滴加到6.1 g乙醇胺中，滴加完成后10 ℃ 反應(yīng)1 h,繼續(xù)滴加30.5 g 40% 溴化氫之后,加入35 mL二甲苯，升溫回流，同時(shí)用分水器分水，減壓蒸餾二甲苯，冷卻，再用丙酮洗滌二次，得產(chǎn)物2-溴代乙胺溴酸鹽17.28 g，收率 84.3%.

將3.9 g疊氮化鈉溶于20 mL蒸餾水中，再加入4.1 g 2-溴代乙胺溴酸鹽，在 75 ℃反應(yīng)21 h后，冷卻到0 ℃，加入20 mL乙醚和4 g氫氧化鉀，分離有機(jī)相，水相用100 mL乙醚萃取3次，合并有機(jī)相，用無(wú)水硫酸鎂干燥過(guò)夜后，過(guò)濾，旋蒸去除乙醚得產(chǎn)物2-疊氮乙胺0.838 3 g,收率48.7%.

將0.515 g海藻酸鈉溶于25 mL MES緩沖液中(50 mM, pH=4). 加入0.288 g，EDC·HCl和0.173 g NHS,活化海藻酸鈉上羧基，再加入346 μL 2-疊氮乙胺或166 μL丙炔胺室溫反應(yīng)24 h后，用透析袋(截留分子量8 000～12 000)透析5 d，最后將溶液凍干得到疊氮基海藻酸鈉(Alg-N)和炔基海藻酸鈉(Alg-C).

1.2.2 海藻酸鈉水凝膠的制備 稱(chēng)取60 mg Alg-N和60 mg Alg-C溶于2.4 mL蒸餾水，再加入1 mL 1%(w/v)的氯化亞銅溶液，劇烈攪拌，幾分鐘后即可到穩(wěn)定的海藻酸鈉水凝膠Alg-Gel.水凝膠用10 mM的EDTA溶液透析12 h, 再用蒸餾水透析24 h.

1.3 海藻酸鈉水凝膠的表征

將干燥的海藻酸鈉、疊氮基海藻酸鈉、炔基海藻酸鈉和海藻酸鈉水凝膠磨碎后，用KBr壓片，由Perkins Elmer-2紅外分光光度計(jì)測(cè)定其紅外光譜圖.

在水凝膠達(dá)到吸水平衡后凍干，凍干后的截面形貌由SEM(Hitachi X650，Japan)觀測(cè).

1.4 水凝膠溶脹比的測(cè)定

精確稱(chēng)取一定量的干凝膠(W0)放入小燒杯中，浸入不同的pH緩沖溶液中，達(dá)到溶脹平衡后取出，用濾紙拭去表面吸附的水后，準(zhǔn)確稱(chēng)取濕凝膠的質(zhì)量(W1)，按下式計(jì)算水凝膠的溶脹比(S).

S=(W1-W0)/W0×100%

2 結(jié)果與討論

2.1 水凝膠的制備與表征

本研究利用乙醇胺通過(guò)溴化反應(yīng)、疊氮化反應(yīng)合成了2-疊氮乙胺，再利用EDC·HCl和NHS將2-疊氮乙胺和丙炔胺分別與海藻酸鈉縮合，得到疊氮基海藻酸鈉和炔基海藻酸鈉，最后用一價(jià)銅催化的疊氮基和炔基的環(huán)加成反應(yīng)制備海藻酸鈉水凝膠.在疊氮化海藻酸鈉和炔基化海藻酸鈉的混合水溶液中加入氯化亞銅水溶液，激烈攪拌靜置幾分鐘后可得到穩(wěn)定的水凝膠，得到的水凝膠需要用EDTA和純水透析，去除亞銅離子.與其它通過(guò)化學(xué)交聯(lián)制備海藻酸鈉水凝膠的方法相比，本方法反應(yīng)條件溫和、簡(jiǎn)單方便.

由于炔基和疊氮基都是特殊功能基團(tuán)，利用紅外圖譜可以表征疊氮化海藻酸鈉和炔基化海藻酸鈉的結(jié)構(gòu)[9].如圖2所示，Alg-C的紅外光譜圖含有2 095 cm-1炔基特征峰，Alg-N的紅外光譜圖含有2 109 cm-1疊氮基特征峰，說(shuō)明通過(guò)氨基和羧基的縮合反應(yīng)可以分別將炔基和疊氮基引入海藻酸鈉中.Alg-Gel紅外圖譜中2 095 cm-1處炔基特征峰消失，2 109 cm-1疊氮基特征峰顯著減小，說(shuō)明炔基化海藻酸鈉和疊氮化海藻酸鈉之間發(fā)生了點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng),生成了化學(xué)交聯(lián)的海藻酸鈉凝膠.

圖3是水凝膠達(dá)到吸水平衡后經(jīng)冷凍干燥后的截面電鏡圖，用點(diǎn)擊化學(xué)制備的海藻酸鈉水凝膠具有與普通水凝膠相同的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，但孔徑較大，平均孔徑大約為60 μm. 通常在制備大孔徑的水凝膠時(shí)，需要加入致孔劑，例如PEG[10]. 致孔劑通過(guò)空間位阻效應(yīng)產(chǎn)生較大孔徑.本研究獲得的大孔徑水凝膠可能是含炔基和疊氮基的側(cè)鏈提供了相類(lèi)似的空間位阻.另外，水凝膠較大的孔徑也可能是凝膠交聯(lián)密度較低所致.

圖1 點(diǎn)擊化學(xué)制備海藻酸鈉凝膠的路線

圖2 海藻酸鈉、海藻酸衍生物和海藻酸凝膠的紅外光譜圖

圖3 點(diǎn)擊化學(xué)制備的海藻酸鈉水凝膠的SEM圖

2.2 水凝膠溶脹行為分析

圖4 pH值對(duì)海藻酸鈉水凝膠溶脹率的影響

通常如果水凝膠含有弱酸性或弱堿性基團(tuán)都會(huì)有一定的pH敏感性.用“點(diǎn)擊”化學(xué)合成的海藻酸鈉水凝膠含有羧酸根.其在一定pH范圍內(nèi)可以轉(zhuǎn)化為羧基，從而影響水凝膠的溶脹率.由圖3顯示出本方法合成的海藻酸鈉水凝膠具有pH敏感性.在溶脹過(guò)程中pH值較高時(shí)，水凝膠中網(wǎng)鏈上的羧酸根帶負(fù)電，由于靜電的相互排斥作用，使得水凝膠網(wǎng)絡(luò)擴(kuò)張，從而溶脹率較高.而隨著pH 值的降低，水凝膠中的羧酸根轉(zhuǎn)化為羧酸，凝膠網(wǎng)絡(luò)中的靜電作用消失，所以溶脹率較低.

3 結(jié) 語(yǔ)

本研究合成了炔基和疊氮基海藻酸鈉，并首次用炔基和疊氮基之間的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)制備了海藻酸鈉水凝膠.由于在水凝膠的制備過(guò)程中炔基和疊氮基側(cè)鏈的空間位阻效應(yīng)使得制備的水凝膠具有較大的孔徑.此外，水凝膠具有pH敏感性.本方法較其它化學(xué)交聯(lián)海藻酸鈉制備水凝膠的方法快速方便，反應(yīng)條件溫和.有望成為藥物控制釋放的載體材料.

參考文獻(xiàn)：

[1] 魯路，劉新星，童真.海藻酸鹽水凝膠化及其在軟骨組織工程和藥物控釋領(lǐng)域的應(yīng)用[J].高分子學(xué)報(bào)，2010，12:1351-1358.

[2] Augst A D，Kong H K，Mooney D J. Alginate hydrogels as biomaterials[J].Macromolecular Bioscience，2006(6):623-633.

[3] Rowley J A，Madlambayan G，Mooney D J. Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials[J].Biomaterials，1999，20(1):45-53.

[4] Bouhadir K H，Hausman D S，Mooney D J. Synthesis of cross-linked poly(aldehyde guluronate) hydrogels[J].Polymer，1999，40:3575-3584.

[5] Parrish B，Breitenkamp R B，Emrick T. PEG and Peptide-grafted Aliphatic Polyesters by Click Chemistry[J]. Journal of the American Chemical Society，2005，127:7404-7410.

[6] Xu X D，Chen C S，Wang Z C，et al. “Click” chemistry for in situ formation of thermoresponsive P(NIPAAm-co-HEMA)-based hydrogels[J].Journal of Polymer Science: Part A: Polymer Chmistry，2008，46:5263-5277.

[7] 楊奇志，劉佳，蔣序林. “點(diǎn)擊”化學(xué)在生物醫(yī)用高分子中的應(yīng)用[J].化學(xué)進(jìn)展，2010，22:2377-2387.

[8] Crescenzi V，Cornelio L，Meo C D，et al. Novel hydrogels via click chemistry: synthesis and potential biomedical applications[J]. Biomacromolecules，2007，8:1844-1850.

[9] 徐玉婷，張燦.基于“點(diǎn)擊”化學(xué)反應(yīng)的聚乙二醇?xì)ぞ厶墙又簿畚锏暮铣杉捌浔碚鱗J]. 中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，41(6):481-486.

[10] Zhang X Z，Yang Y Y， Chung T S，et al. Preparation and characterization of the macroporous poly(N-isopropylacrylamide) hydrogel with fast response[J].Langmuir，2001，17:6094-6099.