李 婧，魏淑英，楊建偉，劉軍河，朱瑞良

（1.山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院，濰坊261061；2. 山東省濰坊市畜牧局，濰坊 261061;3.山東省壽光市畜牧局，壽光262725; 4.山東省淄博市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，淄博255026；5.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，泰安271018）

鴨傳染性漿膜炎是由鴨疫里氏桿菌（Riemerella anatipestifer，RA）引起的一種接觸性、急性或慢性傳染病，主要病理變化是纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、腦膜炎等，發(fā)病率及病死率高[1]，且耐過鴨多成為僵鴨，生長(zhǎng)遲緩[2]，造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。山東濰坊及鄰近地區(qū)肉鴨養(yǎng)殖量大，而鴨傳染性漿膜炎對(duì)1～8周齡的雛鴨都易感[1]，幾乎發(fā)生于肉鴨養(yǎng)殖的全過程[3]，是目前危害肉鴨養(yǎng)殖業(yè)的重要傳染病之一。

本次試驗(yàn)選擇本課題組分離鑒定的3型RA制備兔抗3型RA高免血清和平板凝集診斷抗原，采用平板凝集試驗(yàn)對(duì)來(lái)自山東部分地區(qū)的RA進(jìn)行血清型的初步鑒定，并對(duì)養(yǎng)殖量較大的幾個(gè)縣、市、區(qū)鴨群進(jìn)行3型RA感染情況的血清學(xué)調(diào)查，以了解山東省上述地區(qū)3型RA感染的發(fā)生和流行現(xiàn)狀，為鴨傳染性漿膜炎的防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 WC6株RA為本實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定后保存的菌株，血清型鑒定為3型[2]。

1.1.2 病料 2010年3月至10月收集來(lái)自山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院禽病門診的鴨傳染性漿膜炎疑似病例共93份，分布于濰坊各縣、市、區(qū)及臨近地區(qū)，品種主要為櫻桃谷肉鴨，日齡均為5～30 d。剖檢有纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、腦膜炎等病變，取其腦、心血、肝臟作為被檢病料。

1.1.3 血清 待檢血清372份，采集自壽光、昌樂、昌邑、青州、濰城、寒亭、臨朐、臨淄、高青等縣、市、區(qū)13個(gè)鴨場(chǎng)，均未免疫過任何血清型RA，離心分離獲得血清；RA1型、2型的陽(yáng)性血清由山東省農(nóng)科院家禽研究所惠贈(zèng)；雞白痢沙門氏菌陽(yáng)性血清購(gòu)自哈爾濱獸醫(yī)研究所。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)用家兔購(gòu)自濰坊某養(yǎng)殖場(chǎng)，健康、體壯。

1.1.5 主要儀器 超凈工作臺(tái)SW-TC-2A型購(gòu)自上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；高速臺(tái)式離心機(jī)TGL-16G購(gòu)自上海安亭科學(xué)儀器廠；低速臺(tái)式離心機(jī)80-2B型購(gòu)自上海安亭科學(xué)儀器廠；電熱恒溫培養(yǎng)箱HH.B11購(gòu)自濰坊醫(yī)療器械廠。

1.1.6 主要試劑 巧克力、鮮血、TSA等瓊脂平板培養(yǎng)基為本實(shí)驗(yàn)室自制；腸桿菌科細(xì)菌生化常規(guī)鑒定管購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司；結(jié)晶紫溶液為本實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 方法

1.2.1 RA的分離 無(wú)菌操作取病死鴨的心血、腦、肝等病料接種于巧克力營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，置燭缸內(nèi)37 ℃培養(yǎng)24～48 h，觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)情況、菌落特征，并取疑似菌落進(jìn)行純培養(yǎng)。

1.2.2 分離菌的鑒定

1.2.2.1 形態(tài)及染色特性 病料觸片、美藍(lán)染色后，油鏡下觀察；挑取巧克力瓊脂平板上疑似RA菌落涂片、經(jīng)革蘭氏染色，油鏡下觀察。

1.2.2.2 培養(yǎng)性狀觀察 將疑似菌株分別接種于TSA瓊脂平板、鮮血瓊脂平板、普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板等，置燭缸內(nèi)37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察生長(zhǎng)情況、菌落特征及溶血情況等。

1.2.2.3 生化試驗(yàn) 挑取TSA瓊脂平板、鮮血瓊脂平板上純化的疑似RA菌株，分別接種于各種生化試驗(yàn)微量鑒定管37℃培養(yǎng)3～4 d。鑒定項(xiàng)目包括葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、甘露醇、衛(wèi)茅醇、鼠李糖、蕈糖、水楊素、棉子糖、肌醇、側(cè)金盞花糖、鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、精氨酸雙水解酶、苯丙氨酸脫氨酶、明膠液化、尿酶。

1.2.2.4 PCR鑒定 根據(jù)Genbank公布的RA OmpA基因序列，應(yīng)用Primer 5.0引物設(shè)計(jì)軟件，在其保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物，可擴(kuò)增出412 bp的DNA片段，引物由上海生工生物工程有限公司合成， P1: 5'-ACTCAATTTCTCAGGCGTAG-3'；P2: 5'-AGTGAGTTGCCCATCTC -3'。以 WC6株、大腸桿菌分別設(shè)為陽(yáng)性、陰性對(duì)照。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)及待檢菌株抗原的制備

1.2.3.1 兔抗RA免疫原的制備 將WC6株RA接種于巧克力瓊脂平板培養(yǎng)24 h，用滅菌生理鹽水洗下制成菌懸液；稀釋菌液，使其含菌數(shù)約為2×1010CFU/mL，加入0.3%福爾馬林滅活，37 ℃溫箱24 h后，即可作為制備高免血清的抗原。取抗原按一定比例與油相乳化成油乳劑，作為制備高免血清的油苗[4-6]。

1.2.3.2 平板凝集診斷抗原制備及檢測(cè) 將WC6株RA密集劃線接種于巧克力瓊脂平板上，于37 ℃培養(yǎng)24 h。用滅菌生理鹽水洗下菌苔，充分混勻后，用稀釋滴種法進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)[5]，然后加入終濃度0.4%福爾馬林，37 ℃放置48 h，期間多次振蕩使其充分滅活。6000×g離心15 min，取沉淀菌體，用滅菌生理鹽水洗滌3次。加入結(jié)晶紫溶液（使終濃度為0.001%～0.002%），室溫著染30 min，6000×g離心15 min。取沉淀菌體，用滅菌生理鹽水洗滌5次，再以生理鹽水稀釋成約50億/mL，加終濃度0.01%硫柳汞和0.2%甲醛，4 ℃保存?zhèn)溆肹7]。

用接種環(huán)鉤取一環(huán)染色抗原液，在巧克力營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上劃線，置37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h，觀察有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。

將一滴染色抗原滴在載玻片上，輕輕振搖幾次，靜置4 min，觀察液滴是否均勻一致，有無(wú)自凝現(xiàn)象。分別將RA染色抗原與未經(jīng)稀釋的RA1型、2型、陽(yáng)性血清、雞白痢沙門氏菌陽(yáng)性血清進(jìn)行平板凝集試驗(yàn)，觀察有無(wú)凝集現(xiàn)象。

1.2.3.3 瓊擴(kuò)抗原的制備 將WC株RA及分離獲得的各待檢菌株分別在巧克力瓊脂平板上密集劃線，分別用含0.3%甲醛的PBS洗下一個(gè)平板（9 cm）上的細(xì)菌，經(jīng)沸水浴1 h后，4000×g，20 min，離心取上清液。

1.2.4 兔抗RA陽(yáng)性血清的制備及檢測(cè) 取4只健康青年大耳家兔，首免使用1.2.3.1制備的油乳劑苗皮下多點(diǎn)注射，2 mL/只；7 d后二免，油乳劑抗原皮下多點(diǎn)注射，3 mL/只；7 d后三免，水劑抗原肌肉注射，4 mL/只。三免后7～10 d，采血分離血清[8]。用玻片凝集試驗(yàn)與瓊擴(kuò)試驗(yàn)檢測(cè)血清效價(jià)。

1.2.5 分離菌株血清型的鑒定 用平板凝集試驗(yàn)與瓊擴(kuò)試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。

平板凝集試驗(yàn)：取潔凈載玻片，滴一滴蒸餾水，用接種環(huán)沾取分離獲得的RA純培養(yǎng)物，于蒸餾水中混勻，滴加未稀釋的3型兔抗RA陽(yáng)性血清一滴，將載玻片輕輕反復(fù)搖動(dòng)，或用接種環(huán)涂開，3～5 min后觀察結(jié)果，出現(xiàn)清晰的乳白色絮狀凝集塊者為陽(yáng)性，反之則為陰性[4]。

瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)：瓊擴(kuò)板中NaCl和瓊脂糖的最終濃度分別為8.5%和0.9%，打梅花孔，陽(yáng)性血清加在中央，抗原加在外周孔，置37 ℃濕盒中24 h后，觀察記錄結(jié)果[4]。

1.2.6 血清樣品中3型RA抗體的檢測(cè) 將平板凝集診斷抗原與采集血清樣品作平板凝集試驗(yàn)，測(cè)其感染率。

2 結(jié)果

2.1RA的分離鑒定結(jié)果 在收集的93份病料中，共分離獲得細(xì)菌88株，其中RA39株，陽(yáng)性率41.9%，占細(xì)菌總數(shù)的44.3%；此外大腸桿菌41株，與RA混合感染率為35.9%(14/39)，沙門氏菌8株，與RA混合感染率為20.5%（8/39）。

RA經(jīng)24 h厭氧培養(yǎng)后，在巧克力、TSA、鮮血營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上均生成直徑約1 mm的乳白色半透明露滴狀細(xì)小菌落，連續(xù)傳代后菌落逐漸變大，在鮮血瓊脂上不溶血，在普通瓊脂平板不生長(zhǎng)（見圖1、2）。美藍(lán)染色小球桿狀，兩端著色深，有的位于細(xì)胞漿內(nèi)；革蘭氏染色陰性、球桿狀、多單在（見圖3、4）。

圖1 RA在巧克力營(yíng)養(yǎng)瓊脂上生長(zhǎng)形態(tài)Fig. 1 The growth form of RA in chocolate agar

圖2 RA在鮮血瓊脂上生長(zhǎng)形態(tài)Fig. 2 The growth form of RA in blood agar

圖3 肝臟觸片，美藍(lán)染色（×1000）Fig. 3 Liver with methylene blue staining (×1000)

圖4 RA純養(yǎng)物，革蘭氏染色（×1000）Fig. 4 The culture of RA with gramstaining (×1000)

各分離株生化試驗(yàn)結(jié)果不盡相同，其中較為一致的是苯丙氨酸脫氨酶陰性，對(duì)糖的分解活性都不強(qiáng)，個(gè)別的發(fā)酵一種或兩種糖，表現(xiàn)出弱陽(yáng)性，也有的在培養(yǎng)幾天后又轉(zhuǎn)陰。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂凝膠電泳，均得到412 bp目標(biāo)片段（圖5）。

2.2 平板凝集診斷抗原質(zhì)量檢驗(yàn) 無(wú)細(xì)菌污染、無(wú)自凝現(xiàn)象，與RA血清1型、2型陽(yáng)性血清無(wú)交叉反應(yīng)，特異性強(qiáng)，符合診斷抗原的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

圖5 RA部分菌株OmpA基因片段PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig. 5 PCR for OmpA of some strains of RA

2.3 兔抗3型RA陽(yáng)性血清檢測(cè) 與WC6株菌液反應(yīng)玻片凝集試驗(yàn)為強(qiáng)陽(yáng)性，瓊擴(kuò)試驗(yàn)效價(jià)在1:16以上。

2.4 分離RA的血清型檢測(cè) 在分離獲得的39株RA中，其中3型19株，占RA分離總數(shù)的48.7%。

2.5 血清樣品中3型RA抗體的檢測(cè) 經(jīng)檢測(cè)在372份鴨血清樣品中，抗WC6株RA抗體陽(yáng)性81份，總陽(yáng)性率21.7%。樣品抗體陽(yáng)性率檢測(cè)結(jié)果見表1和表2。

表1 濰坊部分地區(qū)鴨群3型RA抗體陽(yáng)性率Table 1 The antibody positive rate against serotype 3 RA in duck from part area of Weifang, Shandong

表2 不同周齡鴨群3型RA抗體陽(yáng)性率Table 2 The antibody positive rate against serotype 3 RA in duck of different ages

3 討論

3.1 山東省已報(bào)道的RA血清型有1型、2型、3型、7型、8型等, 其中血清1型和2型為主要血清型[7]，但本次試驗(yàn)結(jié)果顯示，血清3型RA在山東濰坊地區(qū)鴨群中感染較為普遍，在發(fā)病鴨群中占細(xì)菌分離總數(shù)的29.4%(19/68)，占RA分離總數(shù)的48.7%（19/39）。血清樣品檢測(cè)總陽(yáng)性率21.7%，個(gè)別鴨群陽(yáng)性率達(dá)到65.0%，感染率相對(duì)較高，且在采樣的各個(gè)縣、市、區(qū)的鴨群中都有分布，說明血清3型RA在濰坊及鄰近地區(qū)的分布廣泛，危害加重，逐漸成為山東省的優(yōu)勢(shì)血清型。

3.2 本次調(diào)查采用平板凝集試驗(yàn)，該方法操作簡(jiǎn)便快速，適于鴨群的定性檢疫，常溫下2～3 min即可檢測(cè)結(jié)果，但反應(yīng)的敏感性相對(duì)較低[2]。有報(bào)道用間接ELISA方法72 h即可檢出RA抗體，而凝集試驗(yàn)直到d 9才出現(xiàn)陽(yáng)性[12,13]。RA主要感染1～8周齡的雛鴨，感染后在鴨體內(nèi)產(chǎn)生的免疫較弱，10～14 d才可產(chǎn)生低凝集效價(jià)[2]，故雛鴨階段的檢出率（17.4%）可能會(huì)比實(shí)際感染率低。超出易感日齡的成年鴨很少再發(fā)病，但雛鴨階段的感染及環(huán)境的污染，使部分鴨成為帶菌鴨，隨著免疫系統(tǒng)的逐漸完善及帶菌狀態(tài)的持續(xù)刺激，使該病的陽(yáng)性率在成鴨階段反而上升(26.1%)。

3.3 鴨傳染性漿膜炎臨床特征與鴨敗血型大腸桿菌病相似，都表現(xiàn)纖維素性滲出性漿膜炎，單純依賴臨床診斷難以區(qū)別[8]。臨床很多人將表現(xiàn)為纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎的病例統(tǒng)稱為“漿膜炎”，因此，臨床門診“漿膜炎”的發(fā)病率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于血清學(xué)調(diào)查的結(jié)果。本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)臨床表現(xiàn)為“三炎”變化的病倒，細(xì)菌分離結(jié)果可能為大腸桿菌、RA、兩者混合感染、少數(shù)還有沙門氏菌與兩者的混合感染，有時(shí)甚至三重感染。其中RA與大腸桿菌混合感染的情況較為普遍，占RA分離率的35.9%（14/39），這給臨床診斷與防治帶來(lái)較大困難。在進(jìn)行分離培養(yǎng)與藥敏試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)同時(shí)考慮到這兩種細(xì)菌，選擇合適的培養(yǎng)基與藥物進(jìn)行試驗(yàn)。

3.4 很多研究表明疫苗免疫可產(chǎn)生有效保護(hù)[11,12]，但RA血清型眾多，不同血清型間交叉保護(hù)率低，對(duì)于一些鴨養(yǎng)殖量大、鴨苗引進(jìn)途徑多的地區(qū)，往往有多種血清型同時(shí)流行，故疫苗選擇必須在了解當(dāng)?shù)豏A血清型流行情況的基礎(chǔ)上，選擇優(yōu)勢(shì)血清型制備疫苗進(jìn)行預(yù)防。本次調(diào)查結(jié)果提示，山東省濰坊及臨近地區(qū)3型RA流行較為廣泛，所以在進(jìn)行鴨傳染性漿膜炎的疫苗免疫時(shí)，除選擇1型、2型等傳統(tǒng)優(yōu)勢(shì)血清型外，還應(yīng)考慮選擇使用含3型RA的多價(jià)苗。

[1]卡爾尼克B W.禽病學(xué) [M]. 高福主譯. 10版. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)社, 1999.

[2]李婧, 朱瑞良, 李舫, 等. 山東地區(qū)3型鴨疫里氏桿菌的分離鑒定及主要生物學(xué)特性研究[J]. 中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào), 2009, 17(3): 49-54.

[3]鄧舜洲, 何后軍, 溫慶琪, 等. 鴨疫里氏桿菌(2型)滅活疫苗的研制[J]. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2002,24(5): 569-573.

[4]張大丙, 郭玉璞. 我國(guó)鴨疫里氏桿菌血清型的鑒定[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào), 1999, 30(6): 536-542.

[5]姜平. 獸醫(yī)生物制品學(xué)[M]. 2版. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2003.

[6]姚火春. 獸醫(yī)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 2001.

[7]鄭立森, 范光勤, 李舫, 等. 山東鴨疫里氏桿菌血清型鑒定及免疫防制[J].畜牧與獸醫(yī), 2005, 37(8): 46-47

[8]王紅寧. 禽呼吸系統(tǒng)疾病[M]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出出版社,2002.

[9]胡清海, 李剛, 鄭明球, 等. 間接ELISA檢測(cè)鴨疫里氏桿菌抗體的研究[J]. 中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào), 1998, 20(6): 352-356

[10]吳彩艷, 覃宗華, 袁建豐, 等. 廣東地區(qū)鴨疫里氏桿菌的血清型及抗藥性情況調(diào)查[J]. 畜牧與獸醫(yī), 2009,41(5): 22-25.

[11]田樹飛, 李子平. 鴨疫里默氏桿菌病原與防治研究進(jìn)展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2007, 35(20): 6150-6151.

[12]李春芬, 李郁, 魏建忠, 等. 鴨疫里氏桿菌病研究進(jìn)展[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2007, 28 (8): 64-67.

[13]鐘登科, 魏建超, 張訓(xùn)海, 等. 鴨疫里氏桿菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J]. 畜牧與獸醫(yī), 2008, 40(7): 86-88.

[14]吳芳, 周紅, 蔡建平, 等. 1株無(wú)致病力的鴨疫里氏桿菌的分離及鑒定[J]. 畜牧與獸醫(yī), 2007, 39(9): 13-15

[15]張福官, 沈政會(huì), 陳建紅, 等. 鴨傳染性漿膜炎的研究進(jìn)展[J]. 安徽農(nóng)學(xué)通報(bào), 2010, 16(4): 52-55.

[16]胡桂學(xué). 獸醫(yī)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程[M]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社, 2006.

[17]程安春, 汪銘書, 陳孝躍, 等. 我國(guó)鴨疫里默氏桿菌血清型調(diào)查及新血清型的發(fā)現(xiàn)和病原特性[J]. 中國(guó)獸醫(yī)學(xué), 2003, 23(4): 320-323.

[18]Subramaniam S, Huang B, Loh H , et al. Characterization of a predominant immunogenic outer membrane protein of Riemerella anati pesti fer [J]. Clin Diagn Lab Immunol,2000, 7 (2): 168-174.

[19]Huang B, Subramaniam S, Frey J, et al. Vaccination of ducks wit h recombinant outer membrane protein (OmpA)and a 41 kDa partial protein ( P45N’)of Riemerel la anati pesti fer [J].Vet Microbiol, 2002, 84 (3): 219-230.

[20]Tsai H J, Liu Y T, Tseng C S, et al. Genetic variation of the ompA and 16S rRNA genes of Riemerella anati pestifer [J].Avian Pathol, 2005, 34 (1): 55-64.