王素娟，劉金明，邢榮鶴，石耀軍，金亞美，李 浩，林矯矯

（中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所 國家防治動物血吸蟲病專業(yè)實驗室 農(nóng)業(yè)部動物寄生蟲學重點開放實驗室，上海 200241）

日本血吸蟲病是典型的人畜共患病，迄今仍是我國重要的公共衛(wèi)生問題之一?；疾〖倚筇貏e是病牛是我國血吸蟲病的主要傳染源[1,2]。我國從20世紀50年代開始大規(guī)模的血吸蟲病防治，先后實施了以滅螺為主的綜合防治對策、以化療為主結合易感地帶滅螺和以控制傳染源為主的綜合防治策略[3]?，F(xiàn)在，廣東、上海、福建、廣西、浙江等5個?。ㄊ袇^(qū)）已阻斷了血吸蟲病傳播，四川省、云南省達到了血吸蟲病傳播控制目標。但由于影響血吸蟲病流行的社會、自然因素未得到根本改變，特別是社會經(jīng)濟的發(fā)展，以前一些行之有效的措施如大規(guī)模的化學藥物滅螺難以繼續(xù)實施，加之家畜血吸蟲病重復感染嚴重，單靠藥物治療難以根除血吸蟲病，因此研制家畜抗日本血吸蟲疫苗是控制血吸蟲病的重要策略。目前雖然已篩選到一些有潛力的候選疫苗分子，但它們所產(chǎn)生的抗日本血吸蟲抗性不能達到現(xiàn)場防治的要求[3]，仍然需要繼續(xù)尋找有效的候選疫苗分子。本課題組在前期工作中利用東方田鼠血清、肝臟和肺臟裂解物篩選44 d日本血吸蟲噬菌體展示cDNA文庫，獲得多個可能與東方田鼠抗性相關靶基因陽性噬菌體克隆[5-7]，并對獲得的部分陽性噬菌體克隆的免疫效果進行了觀察[8,9]，發(fā)現(xiàn)日本血吸蟲假想蛋白SJCHGC068068的噬菌體展示抗原誘導了24.28%的減蟲率以及45.52%肝臟蟲卵減少率。為進一步探索該蛋白作為抗血吸蟲候選疫苗分子的可能性，本文對其編碼基因（暫命名為Sj06868）進行克隆、表達，并對表達產(chǎn)物的免疫效果進行了實驗觀察。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物、質粒及菌株 感染日本血吸蟲中國大陸株安徽品系的陽性釘螺購自于江蘇省血吸蟲防治研究所，以光照法孵出尾蚴；6～7周齡周齡SPF級雄性BALB/c小鼠購于上海斯萊克實驗動物中心；新西蘭白兔( 雄性， 2.5～3.0 kg )購自上海羅涇飛達實驗動物養(yǎng)殖場；質粒pET32a、大腸桿菌Rosetta（DE3）由本實驗室提供。

1.1.2 主要試劑 His Bind Kit購自Novagen公司；TRIzol Reagent為上海英駿生物公司產(chǎn)品；cDNA反轉錄試劑盒、限制性內切酶、T4連接酶、蛋白分子量標準、DNA 分子量標準DL2000/DL15000購自寶生生物工程（大連）有限公司；預染蛋白分子量標準PageR μlerTMPrestained Prorein Ladder為Fermentas產(chǎn)品；HRP-山羊抗鼠購自Sigma公司; 206佐劑由法國賽比克公司饋贈；DNA純化試劑盒（Gel/Gel PCR DNA Fragments Extraction Kit） 為Geneaid Biotech公 司 產(chǎn) 品；Plasmid Minipreps Purification Systems質粒DNA小量快速提取試劑盒為BioDev產(chǎn)品，購自德普生物科技（北京）有限公司；佐劑ESSAIISA 206 CELL由Seppic公司贈送。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物設計與合成 參照NCBI登錄的日本血吸蟲SJCHGC06868蛋白編碼基因的核苷酸序列，利用排primer 5.0軟件，設計引物，分別在上、下游引物的5'端插入BamH I和Xho I酶切位點（下劃線部分），上游引物為：CT GGATCC ATG CTG GAA CAA ACA CGC，下游引物為：AG CTCGAGA CTA ATC TCC TCC CCC GCG AA。引物由上海英俊生物技術有限公司合成。

1.2.2 目的基因的克隆 以腹部貼片法按2000條尾蚴感染劑量感染新西蘭白兔，于感染后7、14、42 d剖檢，以肝門靜脈灌注法收集肝期童蟲。按TRIzol試劑盒、反轉錄試劑盒說明書提取總RNA并合成反轉錄cDNA。以反轉錄cDNA為模板進行PCR擴增，反應條件為：94 ℃預變性 3 min；94 ℃ 變性 30 s，55 ℃ 退火 15 s，72 ℃ 延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。根據(jù)QIANGENE試劑盒的說明書從電泳膠中回收純化PCR產(chǎn)物。將純化的PCR產(chǎn)物以及質粒pET32a分別用BamH I和XhoI雙酶切，分離目的基因片段和線性化載體DNA，用T4連接酶連接，構建重組質粒pET32a-Sj068068并轉化大腸桿菌Rosetta（DE3）。用含有0.5 μg/mL氨芐青霉素、0.34 μg/mL氯霉素的LB固體培養(yǎng)基鋪斑，挑取單克隆菌落，加入含相同抗生素的LB液體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)，小量制備質粒DNA，用BamH I和Xho I雙酶切方法鑒定為陽性克隆后，送上海英駿生物技術有限公司測序驗證。

1.2.3 重組質粒的誘導表達 用含有0.5 μg /mL氨芐青霉素、0.34 μg /mL氯霉素的LB培養(yǎng)基進行表達菌的培養(yǎng)和蛋白表達。將測序正確的陽性菌液接種置于5 mL 培養(yǎng)基中，37℃、250 r/min搖床過夜培養(yǎng)。次日取500 μL培養(yǎng)菌液接種到5 mL含培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)2～3 h，再將5 mL的新鮮菌液加入到1 L培養(yǎng)基中，加入20% IPTG使其終濃度為1 mmoL/L，繼續(xù)培養(yǎng)4～5 h，4 ℃、6 000×g離心15 min，棄上清，加20 mL 1×PBS重懸細菌，-80℃/室溫反復凍融3次，冰浴超聲30 min,其間每超5 s 停10 s。4 ℃、6 000×g離心15 min，移取上清，進行SDS-PAGE分析。

1.2.4 重組蛋白純化及抗原性鑒定 用上述表達菌裂解上清，按說明書操作程序用Ni-NTA HisBind Resin層析柱在非變性條件下分離純化重組蛋白（recombinant Sj068068，rSj068068），分步收集含目的蛋白的洗脫液，用SDS-PAGE電泳對純化的重組蛋白進行鑒定，用紫外吸收法測定蛋白濃度。利用DNAStar生物學軟件分析重組蛋白的抗原性以及主要抗原決定簇，以感染日本血吸蟲14 d的兔血清為一抗，羊抗兔IgG-HRP為二抗，DAB為顯色劑，進行Western blot分析。

1.2.5 動物免疫試驗及保護效果評估 將BALB/c雄性小鼠隨機分組。在新飼養(yǎng)環(huán)境適應1周后，隨機分成3組，每組10只。以ESSAIISA 206 CELL為佐劑，分別于d 0、14、28以背部皮下多點注射方法免疫，每次注射0.1 mL。重組抗原的免疫劑量為每次30 μg /鼠，三免后2周，腹部貼片法攻擊感染日本血吸蟲尾蚴[（40±2）條/只]，感染42 d后剖殺，以肝門靜脈灌注法收集成蟲，分別計數(shù)日本血吸蟲總數(shù)。收集肝臟，取右葉稱重后加入5 mL1×PBS，用均質器按10 000 r/min均質勻漿1 min，加入5 mL 10%NaOH，水浴56 ℃消化1～1.5 h，充分混勻后取20 μL解剖鏡下計數(shù)蟲卵數(shù)，每份樣本計數(shù)3次后取平均值，計算每克肝臟蟲卵數(shù)（eggs per gmm，EPG）。按下列公式計算減蟲率和減卵率：減蟲（卵）率（%）=[對照組平均蟲體數(shù)（EPG平均數(shù)） 實驗組平均蟲體數(shù)（EPG平均數(shù)）]/對照組平均蟲體數(shù)（EPG平均數(shù)）× 100%。

1.2.6 血清抗體測定 于免疫前、每次免疫后一周斷尾采血，剖殺時眼眶采血，離心分離血清。以重組蛋白為檢測抗原，HRP-兔抗鼠IgG為第二抗體，TMB為顯色劑，用常規(guī)間接ELISA法[10]檢測各組血清中的特異性抗體。檢測時抗原包被濃度為10 μg/mL，每孔100μL；封閉液為含1.5%的牛血清白蛋白（BSA)的PBST（1×PBS，0.05%Tween-20）；待檢血清稀釋度為1:100，每孔100 μL；HRP-兔抗鼠IgG工作濃度為1:1000，每孔100 μL。

2 結果

2.1 Sj06868基因的克隆及生物信息學分析從7 d、14 d童蟲中擴增到500 bp左右的DNA片段（圖 1），從42 d成蟲中未能擴增到相應片段。序列分析顯示該片段長度為492 bp，編碼日本血吸蟲假想蛋白SJCHGC068068 C端的163個氨基酸，推導的理論分子量為18 kDa。和Genbank中公布的日本血吸蟲假想蛋白SJCHGC068068的編碼基因序列（登錄號：AY809313.1）相比較，同源性為98%，推導的氨基酸序列同源性為96%；和GenBank中公布的登錄號為FN316908.1的日本血吸蟲假想蛋白全長mRNA序列相比較，缺少N端15個氨基酸的編碼序列，同源性為97.6%，推導的氨基酸序列同源性均為96%（見圖2）。未發(fā)現(xiàn)其他物種的相似同源性序列。利用DNAStar生物學軟件工具分析目的蛋白的抗原性，結果顯示在11～40 aa、75～23 aa、147～164 aa等區(qū)域有良好的抗原性。

圖1 日本血吸蟲Sj06868基因PCR擴增Fig. 1 PCR products of Sj06868

圖2 Sj06868基因的核苷酸序列及推導的氨基酸序列Fig.2 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of the Schistosoma japonicum Sj06868 gene

2.2Sj068068基因的表達 重組質粒pET32a-Sj068068轉化的大腸桿菌Rosetta（DE3）經(jīng)0.1mmol/L IPTG誘導后，獲得高效表達，表達產(chǎn)物為可溶性蛋白，分子量為36 kDa（圖3），用His柱純化后，純化蛋白的獲得率約為58.3 mg/L細菌培養(yǎng)物。

2.3 rSj068068的Western blot分析 用感染日本血吸蟲14 d的兔血清為一抗，羊抗兔IgGHRP為二抗，對純化的重組蛋白rSj068068進行Western blot分析。結果感染日本血吸蟲14 d的兔血清和純化重組蛋白rSj068068有特異性反應，和未誘導的培養(yǎng)菌裂解液沒有反應（圖4）。

圖3 純化重組蛋白rSj068068的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of the purified recombinant fusion protein rSj068068

圖4 重組蛋白rSj068068的western blot 分析Fig.4 Western blot analysis of purified protein

2.4 減蟲率和肝臟減卵率 重組抗原rSj068068與佐劑ESSAI ISA 206 CELL混合后免疫的BALB/c小鼠，攻擊感染后42 d，平均每鼠蟲荷數(shù)為16.50±3.89，與佐劑對照組和PBS對照組相比差異顯著（P<0.05），減蟲率分別為31.63%、29.19%。免疫組平均每克肝臟組織含卵數(shù)為22 873.32±7 683.24，與佐劑對照組和PBS對照組相比，減卵率分別為55.36%、56.27%，差異極顯著（P<0.01）（表1）。

表1 重組抗原rSj068068對BALB/c小鼠的誘導保護性效果Table 1 Protective level of BALB/c mice immunized with rSj068068

2.5 抗體水平的測定 間接ELISA法檢測結果顯示，免疫組抗rSj068068特異性抗體在第一次免疫后即逐步增加，到第三次免疫后達到高峰并一直維持到實驗結束。佐劑對照組、PBS對照組在攻擊感染前均未產(chǎn)生抗rSj068068特異性抗體；攻擊感染后42 d，佐劑對照組、PBS對照組中的抗rSj068068特異性抗體也上升到免疫組水平（圖5）。

圖5 抗 rSj068068特異性抗體檢測Fig.5 Specific antibody response against rSj068068 in each group

3 討論

由于血吸蟲在宿主體內不增殖，其感染所致的最大危害是血吸蟲排出的蟲卵沉積于肝臟引發(fā)免疫病理改變導致肝功能受損，通過免疫減少宿主體內蟲荷量和蟲卵產(chǎn)量，可以達到減輕病變和減少傳播機會。WHO認為只要達到40%減蟲率或減卵率就有一定的應用前景[11]。在本實驗室前期研究中，用含有Sj068068基因片段噬菌體展示抗原誘導了24.28%的減蟲率以及45.52%肝臟蟲卵減少率。在本研究中，重組抗原rSj068068免疫小鼠，與佐劑對照組相比，免疫組獲得了31.63%減蟲率和55.36%肝臟減卵率，與PBS對照組相比，免疫組獲得了29.79%減蟲率和56.27%的肝臟減卵率。可見，Sj068068基因及其產(chǎn)物在抗血吸蟲疫苗研究方面具有進一步研究的潛質。

本研究從7 d、14 d童蟲的mRNA中擴增到Sj068068基因的DNA片段，從42 d成蟲中雖經(jīng)多次PCR擴增亦未能得到相應片段，顯示Sj068068基因是血吸蟲童蟲期高表達基因。對該基因的核苷酸序列及推導的氨基酸序列進行BLASTn分析，發(fā)現(xiàn)其只與GenBank中公布的日本血吸蟲假想蛋白編碼基因序列及推導的氨基酸序列有較高同源性，在其他物種中未找到相似同源性序列，也沒有發(fā)現(xiàn)保守序列和相關功能結構域，推測該基因是日本血吸蟲特有的未知基因。該基因的噬菌體展示產(chǎn)物能被東方田鼠肝臟裂解物識別[6]，而東方田鼠抗血吸蟲特性主要表現(xiàn)為對其體內血吸蟲童蟲具有殺滅作用。因此，該基因可能對血吸蟲生長發(fā)育具有重要作用。

長期以來，我國家畜血吸蟲病診斷主要采用以糞便蟲卵孵化為主的病原學檢測和以蟲卵可溶性抗原為診斷抗原的血清學診斷技術，后者主要為間接血凝試驗。病原學診斷費工、費時且檢出率較低；蟲卵抗原制備難度大，應用蟲卵可溶性抗原建立的診斷技術難以開展早期診斷，也難以區(qū)分既往感染和現(xiàn)癥感染。尋找理想的診斷抗原特別是基因工程抗原依然是當前研究的一個重點。本研究結果顯示，重組抗原rSj068068能被感染日本血吸蟲14 d的兔血清識別；免疫組、佐劑對照組、PBS對照組特異性抗體檢測結果表明，兩個對照組在感染血吸蟲42 d后的特異性抗體也上升到免疫組水平。因此，應用重組抗原rSj068068開展血吸蟲感染的診斷特別是早期診斷的研究可以作為下一步的嘗試。

[1]郭家鋼. 我國血吸蟲病傳染源控制策略的地位與作用[J].中國血吸蟲病防治雜志, 2006, 18(3): 231-233.

[2]Wang T P, Maria V J, Zhang S Q, et al. Transmission of Schistosoma japonicum by humans and domestic animals in the Yangtze River valley, Anhui province, China [J].Acta Tropica, 2005, 96(2-3): 198-204.

[3]周曉莊, 姜慶, 汪天平, 等. 我國血吸蟲病防治研究現(xiàn)狀與發(fā)展戰(zhàn)略思考[J]. 中國血吸蟲病防治雜志, 2004,17(1): 1-3.

[4]汪世平, 陳秀春, 高冬梅, 等. 我國血吸蟲疫苗研究進展和應用前景[J].中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志, 2009,27(5): 402-411.

[5]孫毅, 孫煥, 賈人初, 等. 東方田鼠抗日本血吸蟲抗性相關靶基因篩選[J]. 中國血吸蟲病防治雜志, 2008, 20(1):26-31.

[6]孫換, 劉金明, 石耀軍, 等. 東方田鼠肝臟裂解物篩選日本血吸蟲成蟲噬菌體展示cDNA文庫[J]. 中國預防獸醫(yī)學報, 2008, 30(8): 592-596.

[7]孫煥, 劉金明, 孫帥, 等. 東方田鼠肺臟裂解物篩選日本血吸蟲成蟲噬菌體展示cDNA文庫[J]. 中國獸醫(yī)寄生蟲病, 2008, 16(2): 9-13.

[8]宋震宇, 劉金明, 何金桃, 等. 東方田鼠血清篩選噬菌體展示抗原對小鼠日本血吸蟲病免疫效果觀察[J]. 中國預防獸醫(yī)學報, 2009, 31(4): 52-56.

[9]王素娟, 劉金明, 邢榮鶴, 等. 東方田鼠肝臟裂解物篩選日本血吸蟲噬菌體展示抗原的免疫預防效果[J].中國血吸蟲病防治雜志, 2010, 22(5): 431-436.

[10]Liu J M, Cai X Z, Lin J J, et al. Gene cloning, expression and vaccine testing of Schistosoma japonicum SjFABP[J]. Parasite Immunol, 2004, 26(8-9): 351-358.

[11]Bergquist N R. Controlling schistosomiasis by vaccination:a realistic option? [J]. Parasitol Today, 1995,11(5): 191-194.