詹 媛，陳鴻軍，仇旭升，孫英杰，于圣青，丁 鏟

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

新城疫（newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）引起的急性、高度接觸性的人畜共患病，主要侵害禽類，被OIE列為List A疾病。自1926年ND首次爆發(fā)以來，世界范圍內(nèi)大流行已有3次[1]。ND在中國已存在幾十年，至今仍然是家禽的主要疫病之一。NDV的基因組由單股負(fù)鏈RNA構(gòu)成，基因組按照3'-NP-P-M-F-HN-L-5'的順序編碼6種病毒結(jié)構(gòu)蛋白。

近年來，逐步有研究發(fā)現(xiàn)p38MAPK、PKA以及Akt等磷酸化通路在病毒感染的過程中發(fā)揮了重要的作用。腺病毒可通過PKA和PI3K信號途徑對內(nèi)皮細(xì)胞中連接蛋白40和43的表達進行調(diào)節(jié)。最新研究表明，在流感病毒感染過程中，宿主通過對蛋白磷酸化水平的調(diào)節(jié)進而調(diào)節(jié)病毒蛋白表達和病毒的大量增殖[2]。而在與NDV同屬于副黏病毒屬的水泡性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus，VSV）、呼吸道合胞體病毒（Respiratory syncytia virus，RSV）和麻疹病毒（Measles virus，MeV）中也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的CK-II和PKC等磷酸化激酶參與了病毒的感染過程[3]。關(guān)于磷酸化通路是否參與了NDV的感染過程目前尚無報道。本研究利用蛋白磷酸激酶抑制劑和激活劑研究磷酸化通路在NDV感染中的作用，試圖為NDV復(fù)制機理和抗病毒藥物的研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 毒株和細(xì)胞 本試驗所用病毒毒株為NDV標(biāo)準(zhǔn)強毒 Herts/33，由揚州大學(xué)劉秀梵院士惠贈；雞0系成纖維細(xì)胞細(xì)胞系（DF1）由本研究室保存；細(xì)胞采用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液，常規(guī)37 ℃、5%CO2 培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。

1.2 化學(xué)試劑 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI），SB203580、H-89、staurosporine 和PMA購自Sigma公司；其他生化試劑均為分析純，購自生工生物工程（上海）有限公司產(chǎn)品。

1.3 NDV感染相關(guān)宿主磷酸激酶的初步篩選將DF-1細(xì)胞5×103個/孔接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，使用10% FBS的1640培養(yǎng)基在37 ℃、細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞生長到70%左右時，參考相關(guān)文獻中的濃度，分為5個處理組：PKC抑制劑Staurosporine（100 nmol/L）處理組[4]，PKC激活劑PMA（100 nmol/L）處理組[5]，Staurosporine和PMA聯(lián)用組[6]，p38MAPK 蛋白激酶抑制劑SB203580（20 μmol/L），PKA蛋白激酶抑制劑H-89（10 μmol/L）。每組每孔均加入100 μL的藥物，37 ℃作用4 h后洗去。將10-1到10-9倍比稀釋的病毒尿囊液接種至96孔板中，每一稀釋度接種一縱排8個重復(fù)。最后兩縱排為正常DF-1對照，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，逐日觀察細(xì)胞病變并記錄結(jié)果，按Reed-Muench法計算藥物處理后的 TCID50。

1.4 PKC蛋白激酶抑制劑處理條件的優(yōu)化

1.4.1 PKC蛋白激酶抑制劑預(yù)處理時間對NDV生長的影響 用100 nmol/L的staurosporine分別4 、6 、8 h預(yù)處理細(xì)胞后，接種10倍倍比稀釋（10-1～10-9）的Herts/33雞胚尿囊液，測定病毒的TCID50，確定staurosporine的最適預(yù)處理時間。

1.4.2 PKC蛋白激酶抑制劑濃度對NDV生長滴度的影響 用不同濃度的staurosporine預(yù)處理DF1后，分別接種100×TCID50、50×TCID50和20×TCID50的Herts/33病毒，觀察抑制劑濃度和病毒致細(xì)胞病變能力之間的關(guān)系

1.5 PKC蛋白激酶抑制劑的細(xì)胞毒性實驗

1.5.1 PKC蛋白激酶抑制劑對細(xì)胞形態(tài)的影響將細(xì)胞培養(yǎng)用飛片分別放入35 mm培養(yǎng)皿中，將1×105細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，加入2 mL含10%FBS DMEM培養(yǎng)基，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長到70%左右時，分別用2、5、10、20、50、100、200、400、500 nmol/L staurosporine處理4 h，DAPI染色，正置顯微鏡觀察細(xì)胞核形態(tài)變化。

1.5.2 PKC蛋白激酶抑制劑對培養(yǎng)基pH的影響用培養(yǎng)DF1細(xì)胞所用的DMEM培養(yǎng)基配制2、5 、10、20、50、100、200 nmol/L的staurosporine工作液，用pH計測定其pH值。

1.6 PKC蛋白激酶抑制劑對病毒生長狀況的影響

用20 nmol/L的staurosporine預(yù)處理細(xì)胞4 h，然后用Herts/33病毒感染DF-1細(xì)胞，在感染后的不同時間點收集培養(yǎng)上清，測定TCID50。分別用20、50、100、200 nmol/L的 staurosporine預(yù)處理細(xì)胞4 h，然后用Herts/33病毒感染DF-1細(xì)胞，在感染后的不同時間點收集培養(yǎng)上清，測定病毒的滴度。設(shè)置同樣稀釋倍數(shù)的DMSO作為對照。

2 結(jié)果

2.1 NDV感染相關(guān)宿主磷酸激酶的篩選結(jié)果

2.1.1 PKC激酶抑制劑和激活劑對Herts/33毒力的影響 本實驗所用Herts/33毒株的病毒滴度為109.0TCID50/0.1 mL，而用100 nmol/L PKC激酶抑制劑staurosporine預(yù)處理DF1細(xì)胞4 h后病毒滴度變?yōu)?07.8TCID50/0.1 mL，下降了101.2 個滴度；用100 nmol/L PKC激酶激活劑PMA預(yù)處理DF1細(xì)胞4 h后病毒滴度為108.8TCID50/0.1 mL；若將等量的staurosporine和PMA混合后預(yù)處理DF1細(xì)胞4 h，病毒滴度為108.59TCID50/0.1 mL。用同稀釋度的DMSO預(yù)處理DF1細(xì)胞4 h后病毒滴度為108.8TCID50/0.1 mL（圖1）。

圖1 磷酸激酶抑制劑和激活劑對Herts/33毒力的影響Fig.1 The influence of the of different inhibitors and activators of phosphokinase on the titer of the NDV Herts/33

2.1.2 PKA和p38MAPK抑制劑對Herts/33病毒滴度的影響 本試驗所用Herts/33毒株的病毒滴 度 為 108.5TCID50/0.1 mL， 用 10 μm ol/L/PKA激酶抑制劑H-89預(yù)處理DF1細(xì)胞4 h后測定病毒 滴 度 為108.33TCID50/0.1 mL； 用 20 μm ol/L p38MAPK激酶抑制劑SB203580預(yù)處理DF1細(xì)胞4 h后測定病毒滴度為108.43TCID50/0.1 mL。同時設(shè)置staurosporine和DMSO對照組，用100 nmol/Lstaurosporine和同稀釋度的DMSO預(yù)處理DF1細(xì)胞4 h后測定病毒滴度分別為107.41TCID50/0.1 mL和108.41TCID50/0.1 mL（圖2）。

圖2 PKC蛋白激酶抑制劑處理時間與病毒滴度之間的關(guān)系Fig. 2 The relation between the processing time of proteinkinase C inhibitor and the titer of the Herts/33

2.2 PKC蛋白激酶抑制劑的作用條件

2.2.1 PKC蛋白激酶抑制劑的最佳作用時間用100 nmol/L的staurosporine分別4、6、8 h預(yù)處理細(xì)胞，同時設(shè)置未用藥物的處理組，測定病毒的TCID50，結(jié)果見圖2。

2.2.2 staurosporine的最適工作濃度 無論staurosporine濃度有多高，都無法抑制100 TCID50和50 TCID50的Herts/33病毒，所有的孔都出現(xiàn)細(xì)胞病變。而當(dāng)病毒接種量為20 TCID50時，隨著staurosporine濃度的升高，細(xì)胞病變率逐漸下降（表1）。當(dāng)藥物濃度為400 nmol/L時，對細(xì)胞產(chǎn)生明顯的損傷。

表1 病毒接種量為20 TCID50時staurosporine 濃度與病變率之間的關(guān)系Table 1 The relation between the concentration of staurosporine and the cytopathy post infected with 20 TCID50 Herts/33

2.3 PKC蛋白激酶抑制劑的細(xì)胞毒性實驗

2.3.1 PKC蛋白激酶抑制劑對細(xì)胞形態(tài)的影響分別用 2、5、10 、20 、50、100 、200、400、500 nmol/L的staurosporine處理DF1細(xì)胞4 h后，DAPI染色，以正置顯微鏡觀察，結(jié)果顯示在2 nmol/L至200 nmol/L的濃度范圍內(nèi)，細(xì)胞核形態(tài)無明顯變化（圖3）。當(dāng)濃度大于400 nmol/L時，細(xì)胞受到明顯影響。

圖3 staurosporine濃度對細(xì)胞核形態(tài)的影響Fig.3 The in fluence of different concentration of staurosporine on the shape of cell nucleus

2.3.2 PKC蛋白激酶抑制劑對細(xì)胞培養(yǎng)基PH的影響 測定用DMEM配制成的2、5、10、20、50、100、200 nmol/L的staurosporine工作液的pH值與DMEM培養(yǎng)基的pH值（7.54）無明顯差別，基本穩(wěn)定在7.5左右。

2.4 PKC蛋白激酶抑制劑對病毒增殖的影響

2.4.1 staurosporine對病毒增殖的影響 接種0.01 MOI的 病 毒 2、3、4、6、8、10、12、16、20、24、30、36、42、48 h時分別收集細(xì)胞培養(yǎng)物上清，用TCID50方法測定病毒的滴度。100 nmol/L藥物處理組在8 h后上清中病毒的滴度開始逐漸下降，與未處理組相比48 h后最終約下降100.5個滴度。以時間的log2為橫軸，上清中TCID50的對數(shù)值為縱軸，繪制出細(xì)胞上清中的病毒滴度曲線（圖4）。

圖4 不同試劑處理細(xì)胞后上清中病毒在不同時間的滴度Fig.4 The growth curve of Herts/33 virus infected with chicken embryo fibroblast (DF1)cells which were treated by different reagents

2.4.2 不同濃度的staurosporine對病毒增殖的影響

分別用20、50、100、200 nmol/L的 staurosporine預(yù)處理細(xì)胞4 h，分別在感染后8、16、24、32、40、48 h收集細(xì)胞培養(yǎng)物上清，用TCID50方法測定病毒的滴度。結(jié)果顯示，隨著藥物濃度的增加，上清中病毒的滴度逐漸下降，而DMSO對照組并無影響（圖5）。

圖5 不同濃度staurosporine處理DF1細(xì)胞后對病毒增殖速率的影響Fig.5 The effect of virus propagation rate in DF1 cells which were dealt with different concentrations of staurosporine and infected with Herts/33

3 討論

近年來關(guān)于磷酸化通路與病毒感染進程的相關(guān)性研究逐漸受到了大家的關(guān)注。在研究較為透徹的丙型肝炎病毒中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)宿主細(xì)胞內(nèi)的磷酸化激酶可以使丙肝病毒的F蛋白磷酸化，從而造成蛋白分布的差異進而影響病毒的復(fù)制轉(zhuǎn)錄過程[7]。而通過缺失蛋白磷酸化位點的方法導(dǎo)致病毒的活力衰減也有先例，由此機理構(gòu)建出的弱毒狂犬病毒株已在美國獲得專利。這些研究結(jié)果表明，宿主細(xì)胞的磷酸激酶與病毒的增殖能力之間存在有一定的關(guān)系，迄今為止尚無NDV的P蛋白的磷酸化水平對其功能影響的的相關(guān)報道。但是，已有大量的外國學(xué)者在其他副黏病毒中發(fā)現(xiàn)P蛋白的磷酸化作為一種調(diào)控手段參與病毒的增殖過程[8-13]，這也是本研究的切入點。

已知蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，與介導(dǎo)細(xì)胞的生長、分化和凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)密切相關(guān)[14]。staurospurine（STS）是從鏈酶菌素提取的一種化合物，為經(jīng)典的PKC 抑制劑，主要作用于PKC 的C 端催化區(qū)，抑制PKC 催化底物時與ATP 的結(jié)合[15]。通過staurosporine抑制試驗，我們證實了PKC激酶與NDV增值速率之間存在著一定的相關(guān)性。研究結(jié)果表明，staurosporine可以通過抑制PKC活性進而降低NDV的病毒滴度，而且這種抑制作用可被PKC激酶的專性激活劑PMA所反抑制。除PKC外，病毒可以通過PKA和PI3K途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)蛋白的表達水平也被廣泛證實。在丙肝病毒中，NS3是蛋白激酶A（PKA）和蛋白激酶C（PKC）介導(dǎo)的磷酸化作用的有效調(diào)節(jié)因子，通過影響環(huán)磷酸腺苷（cAMP）及磷脂酰肌醇（PI）等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中蛋白激酶的級聯(lián)反應(yīng)，進而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄、激活特定基因表達。在本試驗中發(fā)現(xiàn)，PKA蛋白激酶的抑制劑H-89和P38MAPK通路的抑制劑SB203580等均對NDV的病毒增殖無影響，這就說明PKC蛋白激酶確實通過對P蛋白磷酸化的影響參與了NDV的增殖調(diào)控。

由于staurosporine還可以參與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)，抑制細(xì)胞的生長并誘導(dǎo)凋亡的產(chǎn)生，所以具有一定的毒副作用。為此，我們測定了staurosporine的最佳作用時間和濃度。結(jié)果顯示，在2 h到6 h的預(yù)處理時間內(nèi)，staurosporine均可以發(fā)揮其抑制功能，以4 h的預(yù)處理時間最為理想。當(dāng)NDV接種量為20個TCID50時，0.4 nmol/L至200 nmol/L的staurosporine均可抑制病變的產(chǎn)生；當(dāng)濃度為50 nmol/L時可達到50%的抑制率。但是這種抑制作用也是有限的，當(dāng)病毒接種量為50和100個TCID50時，無論何種濃度的staurosporine均無法抑制病變的產(chǎn)生，這可能是因為PKC在大量NDV同時感染細(xì)胞時對病毒增殖的調(diào)控作用是有局限性的。

為了直觀的表現(xiàn)出PKC蛋白激酶抑制劑對NDV病毒增殖的影響，我們測定了staurosporine參與下NDV生長曲線的改變。通過與未處理組和DMSO對照組相比較可以發(fā)現(xiàn)，staurosporine處理8 h后起可以發(fā)現(xiàn)病毒的增值速率開始降低，最終下降100.5個滴度。通過不同濃度的staurosporine處理實驗發(fā)現(xiàn)，這種下降程度與藥物濃度呈現(xiàn)出相關(guān)性，隨著藥物濃度的增加，病毒增殖速率下降程度越發(fā)劇烈。此外，我們還可以看出這種抑制作用起始于病毒感染的早期，因為在病毒接種后8 h開始就可以觀察到明顯的差異。

我們認(rèn)為，NDV的磷酸化相關(guān)蛋白可能導(dǎo)致了以上實驗結(jié)果，NDV的基因組由單負(fù)股RNA構(gòu)成，基因組按照3'-NP-P-M-F-HN-L-5'的順序編碼六種病毒結(jié)構(gòu)蛋白。P蛋白的主要功能是與L蛋白、NP蛋白形成有活性的RNA 聚合酶，參與病毒基因組RNA的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，而且P蛋白中的絲氨酸和蘇氨酸含量較高，可作為磷酸化的位點。一般認(rèn)為，P蛋白的磷酸化可以引起蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化或改變等電點，從而促進其與NP蛋白和L蛋白的作用，同時對于自身寡聚體的形成起著至關(guān)重要的作用[16,17]。本文通過初步揭示了PKC蛋白激酶與病毒增殖之間的關(guān)系，并推測這種影響作用可能是通過對P蛋白磷酸化水平的調(diào)節(jié)而實現(xiàn)的，這一研究結(jié)果將對發(fā)現(xiàn)抗NDV病毒藥物靶標(biāo)或研究NDV新型防控技術(shù)具有重要意義。

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