侯軍委，周艷君，王礞礞，李國新，于 海，童光志

（中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

TTV（Torque teno virus，TTV）又稱輸血傳播病毒（Transfusion Transimitted Virus），該病毒最初是由日本學者Nishizawa等采用代表性差異分析法從一名輸血后發(fā)生急性感染的非甲～戊型肝炎患者血清中發(fā)現(xiàn)的[1]。此后，很多國家對本國不同人群中TTV感染進行了流行病學調查，發(fā)現(xiàn)人群的TTV DNA陽性率一般在10%以上[2]。隨后發(fā)現(xiàn)該病毒在自然界各種動物中存在廣泛，能感染人類、靈長類和家養(yǎng)動物包括豬、雞、牛、羊、貓和狗[3]。

TTV是一種無囊膜的單股負鏈環(huán)狀DNA病毒，目前，該病毒被歸為圓環(huán)病毒科，指環(huán)病毒屬[4]。感染不同動物的TTV基因組長度也不同，感染人和猿的TTV基因組長度為3.7～3.9 kb，感染豬和狗的TTV基因組長度分別為2.8 kb和2.9 kb左右，而在貓體內獲得的TTV其基因組長度則約為2.1 kb[5]。目前對于TTV的編碼基因尚未完全確定，有人認為TTV含有4個放閱讀框（ORF1～ORF4）[6]，也有人認為含有6個開放閱讀框（ORF1～ORF6）[7]。

已知感染豬的TTV共兩種基因型，即TTV1和TTV2[8]。有學者對西班牙豬群感染TTV的情況進行了回溯性調查，發(fā)現(xiàn)從1985年到2005年的所有年份均檢出TTV，母豬和肉豬中，TTV1感染率分別為34.2%和30.9%，TTV2感染率分別為46.6%和62.8%，TTV1和TTV2共感染則分別為19.8%和24.5%[9]。有報道證實，歐洲野豬群中TTV感染的總陽性率為84%，其中TTV1和TTV2陽性率分別為58%和66%[10]。目前，應用于豬源TTV檢測的方法仍然以常規(guī)PCR為主，但常常敏感性不夠；套式PCR雖然敏感性更高，但容易出現(xiàn)假陽性。近年來實時熒光定量PCR技術以其特異性強、靈敏度高、重復性好、快速高效等特點在病原檢測以及基因表達水平分析等方面得到了廣泛應用。本研究旨在建立針對豬源TTV1和TTV2的實時熒光定量PCR檢測方法，為病毒檢測以及病毒在體內復制等領域的研究提供快速、簡便和可靠的技術工具。

1 材料與方法

1.1 病料與核酸樣品 檢測病料來自內蒙古和廣西的某豬場；帶有TTV1和TTV2全長的質粒Psk-TTV1和Psk-TTV2由本實驗室構建；豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）、 豬 瘟 病 毒（Classical swine fever virus, CSFV）、豬2型圓環(huán)病毒（Porcine circovirus type 2, PCV2）、 豬 流 感 病 毒（Swine influenza virus，SIV）由本實驗室提供。

1.2 試劑和儀器 Ex Taq DNA聚合酶、Hot Start Ex Taq、dNTP、DNA Marker、pMD18-T載體等均購自大連寶生物有限公司；質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒和基因組DNA提取試劑盒均購自上海華舜生物技術有限公司；大腸桿菌DH5α由本實驗室保存。主要儀器有Mastercycler ep realplex熒光定量PCR儀（Eppendorf公司）。

1.3 引物和探針 應用MegAlign軟件對本實驗室分離的毒株及GenBank數(shù)據庫中的TTV1和TTV2全長核苷酸序列分別進行同源性分析，利用Primer Express 3.0軟件分別在TTV1和TTV2的UTR高度保守區(qū)域設計并合成一對特異性引物和TaqMan熒光探針。探針的5'端標記的熒光報告基團是FAM，3'端標記的熒光淬滅基團為BHQ。TTV1的引物序 列 為QF1：5'- TCCGAATGGCTGAGTTTATGC-3'，QR1：5'- CCGCCCAGTCGCTAGACA-3'，TTV1的 TaqMan探 針 序 列 為：FAM1-CCAGCGGTAGACAGAA ，BHQ1， 擴 增 片 段長度為58 bp；TTV2的引物序列為QF2：5'-TTTATGCCGCTGGTGGTAGAC -3'，QR2：5'-CCCCTTGACTCCGCTCTCA -3'，TTV2的 TaqMan探針序列為：FAM2- AACAGAGCTGAGTGTCTAA，BHQ2，擴增片段長度為86 bp。另外，針對TTV1和TTV2的UTR保守區(qū)域分別設計了一對常規(guī)PCR引物用于制備陽性標準品, 其中，TTV1的引物序列 為 PF1：5'-GCAGTTCCGAATGGCT -3'，PR1：5'-CTTCATGTAGGCCCTC -3'； TTV2的引物序列為 PF2：5'- AGACGAATGGCTGAGTT -3'，PR2：5'-GGGCCCGGTTCCGCTGG -3'。 引 物 由 Invitrogen公司合成，探針由上?；瞪锛夹g有限公司合成。

1.4 病毒基因組DNA的提取 按照Tissue/Cell gDNA Mini Kit試劑盒說明書提取病料組織中的病毒基因組DNA。

1.5 陽性標準模板的制備 以PF1和PR1為引物，擴增Psk-TTV1的UTR保守序列區(qū)；以PF2 和PR2為引物，擴增Psk-TTV2的UTR保守序列區(qū)。二者反應條件相同：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應結束后，取5μL PCR產物在1%瓊脂糖凝膠上電泳檢測擴增結果。回收純化目的片段，分別與pMD18-T載體連接，轉化至DH5α大腸埃希氏菌中，提取質粒進行PCR鑒定和序列測定，挑選測序結果正確的質粒并測定其濃度，獲得pMD18-TTV1和pMD18-TTV2質粒作為陽性標準品模板，根據公式計算出質粒標準品的拷貝數(shù)。

1.6 標準曲線的繪制 用DEPC水對陽性標準質粒進行10倍系列稀釋，TTV1取6個稀釋度作為標準模板，TTV2取9個稀釋度作為標準模板，分別優(yōu)化引物和探針的反應濃度、Tm值及反應時間，進行熒光定量RT-PCR反應 ，計算Ct值并繪制標準曲線。

1.7 特異性試驗 應用建立起來的兩種熒光定量PCR檢測方法分別對本實驗室構建的TTV1全長（TTV1-FJ2） 和 TTV2全 長（TTV2-GD9） 及CSFV、 PCV2、PRRSV、SIV 進行特異性試驗。

1.8 敏感性試驗 用100copies /uL ～107copies /μL陽性標準品做熒光定量PCR，進行敏感性試驗。1.9 重復性試驗 取3份病毒含量不同的樣品進行批間重復性試驗和批內重復性試驗。

1.10 病料的的檢測 應用建立起來的TaqMan實時熒光定量PCR鑒別TTV1和TTV2的檢測方法，檢測采集自內蒙古、廣西等地豬場豬只的組織臟器、全血樣品共計44份，對結果進行統(tǒng)計學分析。

2 結果

2.1 標準曲線的建立 將pMD18-TTV1質粒經10倍系列稀釋至1.88×101～1.88×106copies/μL共6個濃度作為標準品，每個濃度的標準品做3個重復；將pMD18-TTV2質粒經10倍系列稀釋至8.12×102～8.12×109copies/μ L共8個濃度作為標準品分別進行實時熒光定量PCR反應。二者反應體系均為 25μL，包括 10×Ex Taq Buffer（Mg2+Plus）2.5μL，dNTP mix（各 2.5 mmol/L）2.5μL ；上、下游引物（10 pmol/ L）各 1 μL ，探針(10 pmol/L)0.5 μ L ；Ex Taq SH (5 U/μL )0.2 μL , 模板 (質?；?cDNA）5 μL ，DEPC 水 12.3 μL 。二者反應條件一致：95 ℃變性 2 min，以 95 ℃變性 15 s，55 ℃ 退火 15 s ，68 ℃ 延伸 20 s，擴增 45 個循環(huán)，在 68 ℃進行單點熒光檢測。結果TTV1和TTV2的各濃度均有很好的線性關系，陰性對照無擴增反應，其中，TTV1得到標準曲線方程為 y=－3.313×LOG（X）+46.75，相關系數(shù)R2=0.984；擴增效率E=1.00，見圖 1（A和B）；TTV2得到標準曲線方程為 y=－3.449×LOG（X）+50.16，相關系數(shù)R2=0.995；擴增效率E=0.95，見圖 2（A和B）。

圖1 實時熒光定量PCR檢測豬源TTV1的動力學曲線(A)和標準曲線(B)Fig.1 Amplification plots (A)and standard curve (B)of real-time fluorescent quantitative PCR for TTV1

圖2 實時熒光定量PCR檢測豬源TTV2的動力學曲線(A)和標準曲線(B)Fig.2 Amplification plots (A)and standard curve (B)of real-time fluorescent quantitative PCR for TTV2

2.2 特異性試驗結果 以對照病毒PRRSV、CSFV、PCV2、SIV和帶有TTV全長的質粒TTV1-FJ2、TTV2-GD9為模板用建立起來的兩種熒光定量PCR做檢測，結果顯示，針對TTV1的檢測方法檢測PRRSV、CSFV、PCV2、SIV和TTV2-GD9為陰性，檢測TTV1-FJ2為陽性（圖3）；針對TTV2的檢測方法檢測PRRSV、CSFV、PCV2、SIV和TTV1-FJ2為陰性，檢測TTV2-GD9為陽性（圖4），說明本方法具有很好的特異性。

圖3 TTV1熒光定量PCR特異性試驗結果Fig.3 Specificity test of the real-time fluorescent quantitative PCR for TTV1

圖4 TTV2熒光定量PCR特異性試驗結果Fig. 4 Specificity test of the real-time fluorescent quantitative PCR for TTV2

2.3 敏感性試驗結果 將pMD18-TTV1和pMD18-TTV2陽性質粒按照109-100分別倍比稀釋作為模板，進行TaqMan實時熒光定量PCR檢測，兩種檢測方法的最低檢出量均為10 copies/μL（表1）。

表1 Taqman 實時熒光定量PCR的敏感性實驗結果Table 1 Sensitivity analysis of the Taqman real-time fl uorescentquantitative PCR

2.4 重復性試驗結果 對含量不同的TTV1和TTV2病毒感染樣品各3份分別做5個批內重復和批間重復，變異系數(shù)均小于3%，表明該方法重復性良好（見表2和表3）。

表2 實時熒光定量PCR檢測TTV1批內及批間重復試驗結果Table 2 Intra- and inter-batch reproducibility of real-time fl uorescent quantitative PCR assay for TTV1

表3 實時熒光定量PCR檢測TTV2批內及批間重復試驗結果Table 3 Intra- and inter-batch reproducibility of real-time fl uorescent quantitative PCR assay for TTV2

2.5 樣品檢測結果 應用建立起來的TaqMan實時熒光定量PCR鑒別TTV1和TTV2的檢測方法，檢測采集自內蒙古、廣西等地豬場豬只的組織臟器、全血樣品共計44份，結果顯示21份樣品TTV1陽性（47.73%），31份樣品TTV2陽性（70.45%），14份樣品二者均陽性（41.82%），6份樣品二者均陰性（13.64%）（表4）。

表4 應用熒光定量PCR檢測豬組織和血液樣品中TTV的結果Table 4 Detection result of samples with real-time fl uorescent quantitative PCR for TTV1 and TTV2

3 討論

TTV雖然在豬中廣泛存在，卻被認為是沒有致病性的孤兒病毒[14]。通過PCR對豬的組織樣品進行檢測，發(fā)現(xiàn)其DNA主要存在于肺、淋巴結、扁桃體和回腸中[15]。王礞礞等[16]首次對2008～2009年采集自國內7個省份的258份組織樣品進行了TTV感染情況調查，結果證實在我國的豬群中也存在TTV的感染，其中TTV1感染的陽性率為37.6%，TTV2感染陽性率為82.6%，TTV1和TTV2的共感染率為38.4%。Kekarainen等[17]在檢測豬血清中發(fā)現(xiàn)TTV的出現(xiàn)和PCV2的流行具有一定的相關性，在斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）感染的豬中，TTV的感染率為97%，在沒有PMWS感染的豬中TTV的感染率為78%。研究表明PCV2是一種可以和豬共存時間較長的一種病毒，是PMWS的主要誘因之一[18]。王礞礞等[19]對國內豬群中TTV與PCV2共感染的流行病學調查顯示，PCV2和TTV1共感染率為36.4%， PCV2與TTV2共感染率為74.8%。

目前，檢測豬源TTV的方法主要有普通PCR[17]、套式PCR[20]、半套式PCR[21]和滾環(huán)擴增[22]等方法。普通PCR敏感性較差且不能定量，套式PCR、半套式PCR和滾環(huán)擴增耗時較長，而熒光定量PCR檢測方法不僅可以克服上述缺點，而且還可以應用于病毒的復制等領域的研究。

本研究建立的針對豬源TTV1和TTV2的兩種Taqman 實時熒光定量PCR方法，通過特異性、敏感性和重復性試驗驗證，結果表明，這兩種方法均具有較高的靈敏性，最低可檢測到10 copies/μL的陽性標準品；特異性強，對TTV1和TTV2檢測結果為陽性，但對PRRSV、CSFV、PCV2、SIV的檢測結果均為陰性；重復性好，對分別含有TTV1和TTV2的各3份病毒樣品進行5個批內重復和批間重復，變異系數(shù)均小于3%。Taqman 實時熒光定量PCR與SYBR Green PCR和常規(guī)PCR相比，具有更好的特異性和靈敏性，可以用于豬源TTV的定性和定量檢測，實時了解樣品中的病毒含量，在豬源TTV的診斷中具有一定的實用價值。

[1]Nishizawa T, Okamoto H, Konishi K, et al. A novel DNA virus (TTV)associated with elevated transaminase levels in posttransfusion hepatitis of unknown etiology [J]. Biochem Biophys Res Commun, 1997, 241(1): 92-97.

[2]莊輝. TT病毒的研究現(xiàn)狀及展望[J]. 中華內科雜志,1999, 38(11): 727-728.

[3]Kekarainen T, S Lopez-Soria, J Segales. Detection of swine Torque teno virus genogroups 1 and 2 in boar sera and semen [J]. Theriogenology, 2007, 68(7): 71-966.

[4]Biagini P, de Micco P, de Lamballerie X. Identification of a third member of the Anellovirus genus ("small anellovirus')in French blood donors [J]. Arch Virol, 2006, 151(2): 405-408.

[5]Okamoto H, Takahashi M, Nishizawa T, et al. Genomic characterization of TT viruses (TTVs)in pigs, cats and dogs and their relatedness with species-specific TTVs in primates and tupaias [J]. J Gen Virol, 2002, 83(6): 1291-1297.

[6]Okamoto H, Nishizawa T, Kato N, et al. Molecular cloning and characterization of a noval DNA virus (TTV)associated with posttransfusion hepatitis of unknown etiology [J]. Hepatol Res, 1998, 10(1): 1-16.

[7]Yokoyama H, Yassuda J, Okamoto H, et al. Pathological changes of renal epithelial cells in mice transgenic for the TT virus ORF1 gene [J]. J Gen Virol, 2002, 83 (1): 141-150.

[8]Niel C, Diniz-Mendes L, Devalle S. Rolling-circle amplification of Torque teno virus (TTV)complete genomes from human and swine sera and identification of a novel swine TTV genogroup[J]. J Gen Virol, 2005, 86(5):1343-1347.

[9]Segales J, Martinez-Guino L, Cortey M, et al. Retrospective study on swine Torque teno virus genogroups 1 and 2 infection from 1985 to 2005 in Spain [J]. Vet Microbiol,2009, 134(3-4): 199-207.

[10]Martinez L, Kekarainen T, Sibila M, et al. Torque Teno virus(TTV)is highly prevalent in the European wild boar(Sus scrof a)[J]. Vet Microbiol, 2006, 118 (324):223-229.

[11]Hoffmann B, Beer M, Reid S M, et al. A review of RTPCR technologies used in veterinary virology and disease control: sensitive and specific diagnosis of five livestock diseases notifiable to the World Organisation for Animal Health[J].Vet Microbiol, 2009,139(9): 123.

[12]Espy M J, Uhl J R, Sloan L M, et al. Real-time PCR in clinical microbiology: applications for routine laboratory testing[J]. J Clin Microbiol, 2006, 19(1): 165-256.

[13]Ohga S, Nomura A, Takada H, et al. Epstein-Barr virus(EBV)load and cytokine gene expression in activated T cells of chronic active EBV infection [J]. J Infect Dis, 2001,183(9): 1-7.

[14]McKeownN E, Fen auxlu, mengxJ et al. Molecular characterization of porcine TT virus, an orphan virus, in pigs from six different countries [J]. Vet Microbiol, 2004,104(1-2): 113-117.

[15]Bigarre L, Beven V, de Boiss é son C, et al. Pig anelloviruses are highly prevalent in swine herds in France [J]. J Gen Virol, 2005, 86(3): 631-635.

[16]王礞礞, 周艷君, 童光志, 等. 我國豬群中TTV的鑒定及其分子流行病學分析[J]. 中國預防獸醫(yī)學報, 2009,31(10): 751-755.

[17]Kekarainen T, Segales J. Torque teno virus infection in the pig and its potential role as a model of human infection [J]. Vet J, 2009, 180(2): 163-168.

[18]Finsterbusch T, Mankertz A. Porcine circoviruses--small but powerful [J]. Virus Res, 2009, 143(2): 177-183.

[19]王礞礞, 周艷君, 童光志, 等. 豬圓環(huán)病毒2型與豬TTV混合感染的流行病學調查[J]. 中國動物傳染病學報, 2010, 18(1): 75-78.

[20]Kekarainen T, Sibila M , Segales J. Prevalence of swine torque teno virus in post-weaning multi-systemic wasting syndrome (PMWS)-affected and non-PMWS-affected pigs in Spain [J]. J Gen Virol, 2006, 87: 833-837.

[21]Segales J, Martinez G L, Cortey M, et al. Retrospective study on swine torque teno virus genogroups 1 and 2 infection from 1985 to 2005 in Spain [J]. Vet Microbiol,2009, 134(3-4): 199-207.

[22]Niel C, Diniz-Mendes L, Devalle S. Rolling-circle amplification of Torque teno virus (TTV)complete genomes from human and swine sera and identification of a novel swine TTV genogroup [J]. J Gen Virol, 2005, 86:1343-1347.