呂素芳,郭廣君,唐 娜,魏 鳳,沈志強,2

2.山東綠都生物科技有限公司,濱州 256600

豬胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)是引起豬傳染性胸膜肺炎(Porcine infectious pleuropneumonia)的致病菌,屬于巴氏桿菌科嗜血桿菌屬。豬胸膜肺炎放線桿菌是一種革蘭氏陰性桿菌,具有很高的致病性,由本菌引起的豬接觸性傳染性胸膜肺炎是豬的呼吸道傳染病,各種年齡的豬均易感,本病在臨床上常見,一旦發(fā)生感染則很難從豬場中根除。受感染的豬急性癥狀表現(xiàn)為具有高死亡率的纖維素性肺炎和胸膜炎,慢性癥狀表現(xiàn)為可造成動物生長緩慢的肺損傷,給世界各地的養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的經(jīng)濟損失,己成為嚴重危害現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)的重要傳染病之一[1-2]。由于本病在急性期中有大量的鼻排泄物,所以有可能通過衣服、膠靴或儀器傳播,應注意防護。對APP的病原學、血清型和流行特點的系統(tǒng)研究可以提高診斷和防控該病的水平。

1 血清型分類

APP的血清型較多,其血清型的劃分是依據(jù)莢膜多糖和菌體脂多糖的抗原性不同來區(qū)分的,目前己鑒定出15種血清型[3],由于各血清型間的抗原性和病原性不盡相同,導致不同血清型間沒有交叉保護力,從而增加了該病防治的難度。根據(jù)培養(yǎng)時是否需要NAD,可將其分為生物I型和生物II型[4-5],其中APP 1～12型和15型是典型的生物Ⅰ型。其中血清Ⅰ型被分成2個亞型即1A和1B,血清5型被分成2個亞型即5A和5B。APP-13型和APP-14型為生物Ⅱ型,分布于歐洲及美國。我國流行的血清型為 1、2、3、5、7、10 等型 ,以 1、3 、7 型為主[6-7]。主要血清型間缺乏很好的交叉免疫性。由于APP的血清型眾多,各血清型間無交叉保護以及各地流行背景日益復雜致使該病難以控制,臨床上急需多價、高效的疫苗預防和控制該病,因此對APP的檢測和分型對防治至關重要。

2 毒力因子

胸膜肺炎放線桿菌的毒力因子有很多,其中主要包括溶血素(Apx)、莢膜多糖(Capsularpolysaccharide,CP)、脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)、外膜蛋白(Outer membrane protein,OMP)、轉鐵結合蛋白(T ransferrin binding protein,Tbp)、蛋白酶(Protease)、滲透因子(permeate factor,PF)、黏附素等[8-9]。這些毒力因子都能引起胸膜肺炎的發(fā)生,其中溶血毒素、莢膜多糖、脂多糖、外膜蛋白在胸膜肺炎發(fā)生過程中扮演著更為重要的角色,也是主要的免疫原性物質(zhì)。

2.1 溶血毒素(Actinobacillus pleuropneumoniae RTX-toxin,Apx) 毒素是APP主要的毒力因子,屬于RTX毒素(repeats in toxin)家族,在所有的15個App血清型中共分泌 4種 Apx毒素,分別為ApxⅠ 、ApxⅡ 、ApxⅢ和ApxⅣ。前3種Apx毒素既是App致病的主要毒力因子,又是App主要的保護性抗原[10],對于疾病臨床癥狀的出現(xiàn)以及典型的肺部病變是必需的。不溶血的突變株不能對動物產(chǎn)生保護力,不產(chǎn)毒素的菌株只能對其相應血清型的感染產(chǎn)生保護,而不能對其他血清型的感染產(chǎn)生保護。不同的血清型分泌不同的毒力因子,對宿主產(chǎn)生不同的致病性,因此毒力因子及其基因與血清型存在著密切的關系。

2.1.1 ApxI 相對分子質(zhì)量為105 ku,具有很強的溶血活性[11],對肺泡巨噬細胞和中性粒細胞也具有很強的細胞毒性作用,血清型1,5,9,10,11和14均能表達并分泌。有活性的ApxI受一個操縱子的調(diào)控,包括4個基因,即ApxI CABD。ApxIA基因編碼毒素蛋白的前體,ApxIC基因編碼毒素翻譯后的激活物,ApxI BD基因的產(chǎn)物負責毒素的分泌。在血清型1,5a,5b,9,10和11中,存在完整的ApxI的操縱子,它們產(chǎn)生具有強溶血和強細胞毒性的ApxI。這幾種血清型也往往造成傳染性胸膜肺炎的急性爆發(fā)。此毒力基因在幾個血清型間均有交叉抗原性,可利用其高度的保守性對此類血清型APP進行正確診斷,特別是APP 10型菌只分泌ApxI而不分泌其他毒素,因此可利用ApxI作為診斷抗原,全面確診該病有著重要的臨床意義。嚴克霞等[12]利用毒性極強的APP21菌株表達的ApxIA毒素,與天然毒素進行免疫原性比較,結果復性的重組表達蛋白和天然毒素均具有較好的免疫原性,對小鼠產(chǎn)生較好的免疫保護。馬艷芳[13]等研究毒素Apx l對小鼠的致病性及免疫原性,結果含ApxI的亞單位油乳劑疫苗抵抗異源血清型的APP攻擊時可以起到一定的保護作用。Liu等[14]在血清7型活疫苗株HB04C-基礎上,利用穿梭載體構建共表達Apx-IA基因的免疫原性增強的多價弱毒APP疫苗株HB04C2,來預防豬的呼吸系統(tǒng)疾病。對其進行生物學特性研究,發(fā)現(xiàn)穿梭載體攜帶的ApxIA基因在疫苗株HB04C2里穩(wěn)定表達,且不影響疫苗株的生長能力。作為活疫苗對豬進行氣管內(nèi)給藥,可以產(chǎn)生抵抗ApxIA和ApxIIA毒素的抗體,所有免疫豬均可以抵抗來自不同血清1型APP流行株的攻擊。結果表明,APP活疫苗株可以作為載體來表達不同的抗原。Zou H等[15]進行了APP血清10型弱毒株apxIC-/P36+的構建與分析研究,結果與親本株比較,體外培養(yǎng)的缺失株具有同樣的生長效率且在老鼠體內(nèi)毒力減弱。動物實驗表明,缺失apxIC基因的突變株能與親本株一樣成功誘導免疫反應。Chiang CH等[16]評價編碼ApxIA或ApxIIA基因的DNA疫苗在小鼠體內(nèi)的免疫反應和保護效率。對小鼠肌肉注射疫苗后成功誘導了較強的體液免疫反應,二價疫苗可同時誘導Th1和Th2免疫反應。利用APP血清1型進行攻毒保護試驗,結果,pcDNA-apxIA疫苗組和pcDNA-apxIA/pcDNA-apxIIA二價疫苗組的保護效率顯著高于陰性對照組,而pcDNA-apxIIA疫苗組只提供有效的保護效率,與對照組相比不明顯,證明二價疫苗為最佳。DNA疫苗作為第3代疫苗為APP免疫提供新思路。

2.1.2 ApxⅡ 相對分子質(zhì)量為105 ku,對肺泡巨噬細胞和中性粒細胞也具有細胞毒性作用,因此它也被稱作clyⅡ(cytolysinⅡ)。ApxⅡ的操縱子與前者稍有不同,即ApxⅡCA操縱子和ApxⅠBD操縱子。除10和14型外,所有的血清型都可分泌此毒素。ApxⅡCA基因在所有的血清型中都非常保守,幾乎沒有變異。ApxⅡ毒素具有良好的免疫原性。王春來等[17]利用ApxⅡA基因構建原核表達載體,結果在BL21中一包涵體形式表達,經(jīng)Western blot檢測,產(chǎn)物具有良好的免疫原性,可以作為抗原用于ELISA診斷。李任峰等[18]利用生物信息學方法對AY232288.1菌株(湖北分離株)的ApxllA基因及其蛋白質(zhì)結構進行了分析和預測,結果745-751和801-807氨基酸序列區(qū)段可能是B細胞表位優(yōu)勢區(qū),為 ApxllA基因功能的深入研究及APP多表位疫苗的設計奠定了基礎。賈凡等[19]研制的ApxⅡ-ELISA試劑盒能夠有效的診斷豬傳染性胸膜肺炎。同時也可作為一種評價豬群免疫后免疫效果的有效方法。

2.1.3 ApxⅢ 沒有溶血活性,但其對肺泡巨噬細胞和中性粒細胞有很強的細胞毒性作用。ApxⅢ操縱子具有完整的ApxⅢCABD基因,編碼120 ku的蛋白。其中ApxⅢA基因編碼毒素的結構蛋白,ApxⅢBD基因具有高度同源性。ApxⅢ毒素存在于血清型2,3,4,6,8,15中,其中3型只能分泌ApxⅢ毒素,故毒力較弱。邵美麗等[20]以APP-2型參考株基因組為模板,擴增出ApxⅢA基因3.1 kb的片段,構建原核表達載體并獲表達,Western blot證明融合蛋白具免疫學活性。

2.1.4 ApxⅣ 是近幾年才發(fā)現(xiàn)的一種毒素,相對分子質(zhì)量為202 ku。APP所有血清型在體內(nèi)均可分泌ApxⅣ,該毒素毒力很弱,只有在動物體內(nèi)才會被誘導表達,在任何培養(yǎng)基上均不表達。這是APP中迄今發(fā)現(xiàn)的惟一一個只在體內(nèi)表達的基因。ApxⅣ的種間特異性很強,是APP中特異的毒素蛋白,不與其他親緣關系較近的種屬的抗血清發(fā)生交叉反應,是良好的診斷試劑抗原[21]。國內(nèi),許多學者利用PCR技術擴增ApxⅣ基因的片段或全序列,已取得比較滿意的效果。Dreyfus等[22]用ApxⅣ基因的原核表達蛋白,進行免疫印記法檢測APP感染情況,結果靈敏度達100%,用該蛋白包被抗原制成ELISA試劑盒,可對感染后3 w的豬作出檢測,同時可鑒別疫苗毒和野毒(differentiate infected from vaccinated animals,DIVA)。O'Neill C等[23]對英國地區(qū)APXIVA-DIVA方法進行分析總結。Apx IVA毒素是區(qū)別APP自然感染毒和疫苗毒的首選抗原,將ISApl1插入apxIVA基因是常用的建立ApxIVA-DIVA的方法,但在apxIVA基因內(nèi)存在一個潛在的TGG到TGA的點突變。插入ISApl1后,除了兩個血清3型分離株外,同樣來自英國的其他血清2/3/6-8和12血清型均未發(fā)現(xiàn)突變,幾率為18.1%。Liu J等[24]在apxIIC-缺失突變株的基礎上獲得apxIVA突變株,通過在豬體內(nèi)感染試驗來評價其毒力。記錄了豬體的臨床癥狀、肺臟損傷情況、血液的生化指標和組織病理學變化。結果表明,未缺失ApxIVA基因的APP菌株致病性更強,揭示ApxIVA基因是APP完全毒力必須基因。Wang C等[25]研究了rApxIVN在豬抵抗APP感染中的免疫保護作用。以(rApxIVN)Ⅰ組、(rApxI+rApxII+rApxIII+rApxIVN+rOMP)Ⅱ組、(rApxI+rApxII+rApxIII+rOMP)Ⅲ組和 PBS組,分別免疫豬,用血清1型分離株JMS 06和血清2型分離株FX 01攻毒。結果Ⅰ組和Ⅱ組均產(chǎn)生了較高的針對rApxIVN的抗體滴度。針對 rApxI,rApxII,rApxIII和rOMP的抗體滴度方面,Ⅱ組比Ⅲ組高。攻毒后,Ⅰ組免疫的豬表現(xiàn)了嚴重的呼吸癥狀和肺臟損傷,與對照組類似。Ⅱ組和Ⅲ組針對兩個血清型均能提供保護,與Ⅲ組相比,Ⅱ組產(chǎn)生了輕微的肺損傷和發(fā)熱感染。結果表明,rApxIVN作為抗原可以提供針對APP攻擊的保護。Yang W等[26]建立了針對APP apxIVA基因的環(huán)介導等溫擴增(LAMP)技術,對15株APP菌株和7株其他菌株進行擴增,與常規(guī)PCR比較,結果特異性相當,敏感性強10倍。臨床應用顯示,通過細菌分離試驗、巣式PCR和LAMP對比,65份采自健康豬的樣品結果均為陰性,115份采自有明顯呼吸癥狀豬的樣品結果,22份陽性。與巢式PCR相比,LAMP表現(xiàn)出更高的敏感性,是一種檢測APP感染的可靠方法。

2.2 莢膜多糖(CPS) 莢膜的化學結構主要由重復單糖組成,莢膜多糖CPS結構是 App在豬體內(nèi)合成和生長的重要成分。莢膜多糖決定App的血清型抵抗力和毒素強度方面的重要性。不同菌種間莢膜的毒力及免疫原性的差別可能與莢膜成分和結構有關,莢膜所表現(xiàn)的毒力與宿主防御系統(tǒng)與莢膜本身之間的相互作用機制有很大的關系。通常莢膜的結構、組成甚至厚度都可以影響到APP菌株的毒力[27]。一般來說,莢膜越厚毒性越強。Aloka B等[28]對莢膜多糖的3個開放閱讀框cps1A,cps1B和cps1C進行研究,通過分子生物學手段獲得不同的缺失菌株,研究產(chǎn)生CP的能力。結果表明不同種類莢膜多糖可能通過表達機制來影響其毒力。

2.3 脂多糖(LPS) 脂多糖的毒力主要是脂質(zhì)A的作用。脂質(zhì)A可以激發(fā)機體防御系統(tǒng),最終導致組織損傷;另外,脂多糖還可增強溶血素對巨嗜細胞的毒性作用。相同的LPS的O-鏈表面抗原決定簇可以被多個不同的血清型同時擁有,如3、6、8型的O-鏈組成相似,1、9、11型的 O-鏈組成相似,4、7 型的O-鏈組成相似,這是血清型交叉反應的主要原因。LPS免疫原性很弱,刺激產(chǎn)生的LPS抗體,只能抵抗發(fā)病,不能抵抗感染,且具有血清型的特異性,只能對APP的攻擊提供部分的保護。Tumamao等[29]的研究也表明這一點。

2.4 外膜蛋白(Omp) 具有免疫原性,其基因兩端保守,具有種特異性,中間易變異,5′端保守區(qū)域約200 bp,3′端約100 bp,中間變異區(qū)約700 bp。根據(jù)中間變異區(qū)將App生物Ⅰ型分為4個群,1、9、11、12型為一群 ,3、4、6、7 型為一群,5、10 型為一群,2、8型為一群。楊建德等[30]通過基因組文庫篩選獲得外膜蛋白基因,克隆表達該外膜蛋白。Western blot結果表明,該蛋白與APP康復期血清發(fā)生反應,為最終建立APPELISA檢測方法奠定了基礎。邵美麗等[31]以APP血清7型25-4株DNA為模板,擴增OMP基因,構建原核表達載體pGEX-omp,純化表達的蛋白,經(jīng)ELISA檢測,該蛋白與兔抗APP的陽性血清反應,具有很好的免疫活性。

2.5 轉鐵結合蛋白(Transferrin Binding Proteins,Tbp) APP的轉鐵結合蛋白有2種不同的蛋白構成,即轉鐵結合蛋白A(TbpA)和轉鐵結合蛋白B(TbpB),它們是功能性的轉鐵結合蛋白受體,而且特異性的針對豬轉鐵蛋白。近年來的研究表明,TbpA和 TbpB是APP的主要毒力因子,Baltes等[32]用缺失tbpA和tbpS的血清7型突變株感染動物,發(fā)現(xiàn)無任何臨床癥狀,不能引起機體的體液免疫反應,從感染的豬的扁桃體、肺、淋巴結及心臟中分離不到細菌。研究發(fā)現(xiàn)轉鐵結合蛋白也具有一定的保護性,用60 kD的 Tbp2免疫的豬只能對相同血清型菌株的攻擊可以提供部分保護。Overbeke等[33]發(fā)現(xiàn)當用Top與Apx混合免疫時,可以對血清9型提供100%的保護,但仍不能完全抵抗肺部病變及細菌在體內(nèi)的定居。

3 研究展望

Apx毒素作為App最主要的毒力因子,同時也是最重要的保護性抗原,能誘導機體產(chǎn)生最大的保護力,且無須莢膜抗原的參與,對于不同血清型之間的交叉保護也起著重要的作用,是高效疫苗不可或缺的成分。在細菌滅活菌苗中加入細菌產(chǎn)生的Apx后,疫苗的保護力大為提高,主要成分為毒素的亞單位疫苗對動物的保護力優(yōu)于缺少 Apx毒素的商業(yè)滅活苗。由于提取天然Apx的方法成本較高,產(chǎn)量低,不易實現(xiàn)大規(guī)模的生產(chǎn),因而利用基因工程的方法,將毒素基因在廉價的原核表達系統(tǒng)大腸桿菌內(nèi)高效表達,易于大規(guī)模培養(yǎng),并降低了生產(chǎn)成本,且免疫原性和天然毒素沒有差異。在研制疫苗時,對親本株的選擇上,要么是分離本地具強毒力的優(yōu)勢血清型,因其可以提供菌體以及毒素抗原,產(chǎn)生最大限度的保護;要么使疫苗含有多種血清型,能夠盡可能地包括4種毒素,也就可以提供更全面的保護。

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