董昶 綜述 華清泉 劉陽 審校

內(nèi)淋巴積水豚鼠模型制作

董昶1綜述 華清泉1劉陽2審校

自1861年法國學(xué)者Prosper Meniere首次報(bào)道了梅尼埃病以來，后人從病因、病理、生理、診斷、治療等各方面對其進(jìn)行了大量的研究。1938年Hallpike首先通過梅尼埃病患者顳骨尸檢揭示了梅尼埃病的組織病理學(xué)特征為膜迷路積水。由于涉及倫理道德等問題，繼續(xù)研究梅尼埃病需要尋找一種與人耳結(jié)構(gòu)相似且制作膜迷路積水簡便的動(dòng)物。豚鼠聽覺靈敏且其顳骨與人類顳骨相似，已成為耳科學(xué)研究常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。本文就目前建立豚鼠膜迷路積水模型的原理、方法、成功率及特點(diǎn)等進(jìn)行綜述。

1 減少內(nèi)淋巴吸收誘導(dǎo)內(nèi)淋巴積水

內(nèi)淋巴液的產(chǎn)生和吸收是動(dòng)態(tài)平衡的過程，此類模型制作原理是基于內(nèi)淋巴囊是內(nèi)淋巴液吸收的主要部位，通過直接阻斷內(nèi)淋巴管和囊、破壞內(nèi)淋巴囊周圍血管，間接影響內(nèi)淋巴液吸收，從而導(dǎo)致內(nèi)淋巴積水。

1.1 阻塞內(nèi)淋巴管和囊致內(nèi)淋巴積水

1.1.1 頂枕進(jìn)路阻塞內(nèi)淋巴管和囊 Kimura等［1］通過手術(shù)阻塞豚鼠內(nèi)淋巴管和囊，首次在豚鼠體內(nèi)復(fù)制出膜迷路積水模型，從而為研究內(nèi)淋巴積水的內(nèi)耳組織學(xué)、病理生理學(xué)等創(chuàng)造了一條全新的途徑。方法：豚鼠麻醉后作頭皮正中切口，切除枕骨大孔背側(cè)緣至人字縫的枕骨。然后在小腦處切開硬腦膜，巖骨近橫竇處小龕即內(nèi)淋巴囊中部標(biāo)記，用鉆頭鉆穿前庭導(dǎo)水管，破壞內(nèi)淋巴囊后沿導(dǎo)管方向再繼續(xù)追進(jìn)，最后在鉆孔內(nèi)置入骨蠟，枕骨缺損處填塞明膠海綿，縫合皮膚。

1.1.2 后顱窩硬膜外進(jìn)路阻塞內(nèi)淋巴管和囊 為了解決上述制作方法創(chuàng)傷過大的不足，Konishi［2］創(chuàng)立了后顱窩硬膜外進(jìn)路內(nèi)淋巴囊導(dǎo)管阻塞術(shù)。方法：豚鼠麻醉后行顱頂正中切口，磨去術(shù)側(cè)枕骨暴露硬腦膜及乙狀竇，剝離硬腦膜至乙狀竇前緣，在前庭導(dǎo)水管顱內(nèi)開口處切斷內(nèi)淋巴囊。再用微電鉆沿前庭導(dǎo)水管方向鉆入，破壞骨內(nèi)部分淋巴囊和部分內(nèi)淋巴導(dǎo)管，然后填以骨蠟、明膠海綿，縫合切口。

王宜南［3］按照Kimura的方法制作豚鼠內(nèi)淋巴積水模型，通過火棉膠切片比較不同術(shù)后存活時(shí)間豚鼠內(nèi)淋巴積水的發(fā)生率，結(jié)果2～9天為58.3%，10～29天為78.3%，30～55天為100%，總計(jì)積水發(fā)生率為80.3%。之后陸續(xù)有學(xué)者報(bào)道手術(shù)方法制作內(nèi)淋巴積水模型成功率可達(dá)100%。

通過手術(shù)方法制作豚鼠內(nèi)淋巴積水模型的缺點(diǎn)是破壞性過大，造模所需時(shí)間較長。另外，臨床上發(fā)現(xiàn)只有37%的梅尼埃病患者存在解剖異常［4］，此法只能解釋這些存在顱內(nèi)解剖異常影響內(nèi)淋巴回流的現(xiàn)象，并非梅尼埃病的生理模型。其優(yōu)點(diǎn)是造模成功率很高，是制作內(nèi)淋巴積水的可靠方法。

1.2 破壞內(nèi)淋巴囊周圍的血管致內(nèi)淋巴積水 內(nèi)淋巴囊的血液供應(yīng)主要來自內(nèi)耳的前庭后動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈的分支—腦膜后動(dòng)脈，靜脈回流則是通過橫竇。Lee［5］等通過切斷腦膜后動(dòng)脈和前庭導(dǎo)水管外口上、下的乙狀竇制作出了內(nèi)淋巴積水模型。方法：豚鼠麻醉后暴露橫竇的彎曲部分全長，然后縱行切開后顱窩的腦膜，腮蓋的凹陷骨龕即是前庭導(dǎo)水管外口的位置。將乙狀竇輕輕從骨溝中提起，結(jié)扎后切斷，用眼科燒灼器燒灼前庭導(dǎo)水管外口上下的乙狀竇。因腦膜后動(dòng)脈與乙狀竇彼此靠近，故在切除乙狀竇的同時(shí)也切斷了腦膜后動(dòng)脈。使用明膠海棉填補(bǔ)骨質(zhì)缺損，縫合肌肉和皮膚。采用火棉膠切片觀察膜迷路積水程度，1～2個(gè)月后所有豚鼠都出現(xiàn)了耳蝸輕到中度內(nèi)淋巴積水，球囊出現(xiàn)了中重度的積水，而橢圓囊呈現(xiàn)輕度積水。該方法制作內(nèi)淋巴積水成功率高，缺點(diǎn)是過程稍繁瑣。

1.3 內(nèi)淋巴囊遠(yuǎn)端燒灼或全切法致內(nèi)淋巴積水 Dunnebier［6］為了對內(nèi)淋巴囊的破壞程度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，即僅僅導(dǎo)致內(nèi)淋巴囊骨外部分遠(yuǎn)側(cè)端輕度纖維化而創(chuàng)立了這兩種方法。①燒灼法：麻醉后豚鼠經(jīng)顱后凹硬膜外徑路暴露術(shù)耳內(nèi)淋巴囊，用硝酸銀燒灼內(nèi)淋巴囊的遠(yuǎn)側(cè)端，最后縫合切口。②全切法：切除乙狀竇和內(nèi)淋巴囊遠(yuǎn)端間的聯(lián)系并塞入小片乳膠片將其隔開，后塞入可吸收海綿，縫合切口。手術(shù)后23天，采用耳蝸組織切片觀察內(nèi)淋巴積水程度，結(jié)果，燒灼法可致40%豚鼠出現(xiàn)輕度積水，且主要出現(xiàn)在頂回；全切法可致75%豚鼠出現(xiàn)中重度內(nèi)淋巴積水，積水程度較一致。

作者認(rèn)為這兩種方法的原理均是影響到了內(nèi)淋巴囊的靜脈回流從而影響其對內(nèi)淋巴液的吸收，其優(yōu)點(diǎn)是組織破壞較少，內(nèi)淋巴積水程度較為一致，缺點(diǎn)是成功率稍低。

2 增加內(nèi)淋巴液的產(chǎn)生誘導(dǎo)內(nèi)淋巴積水

傳統(tǒng)理論認(rèn)為內(nèi)淋巴液的產(chǎn)生受血管紋邊緣細(xì)胞和橢圓囊及半規(guī)管壺腹部的暗細(xì)胞膜上的Na／K泵控制。此類模型制作方法同樣是基于打破內(nèi)淋巴液產(chǎn)生和吸收之間的動(dòng)態(tài)平衡，通過各種激活劑激活Na／K泵，從而誘導(dǎo)內(nèi)淋巴積水。

2.1 血管加壓素（或醛固酮）致內(nèi)淋巴積水 Takeda［7］曾報(bào)道內(nèi)淋巴積水導(dǎo)致的內(nèi)耳功能紊亂患者的血漿中血管加壓素（VP）濃度增加，并與臨床癥狀相關(guān)。1998年Kumaga-

1 武漢大學(xué)人民醫(yī)院耳鼻咽喉－頭頸外科（武漢 430060）；

2 海軍總醫(yī)院全軍耳鼻咽喉－頭頸外科中心

通過血管加壓素（或醛固酮）誘導(dǎo)豚鼠內(nèi)淋巴積水，過程簡單，時(shí)間短，成功率高，遺憾的是此法誘導(dǎo)的內(nèi)淋巴積水轉(zhuǎn)歸尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

2.2 霍亂毒素致內(nèi)淋巴積水 Lohuis等［10］通過外淋巴灌注霍亂毒素，使中階上皮細(xì)胞中的腺苷酸環(huán)化酶活化，從而產(chǎn)生大量c AMP，后者能誘導(dǎo)內(nèi)淋巴液大量分泌致內(nèi)淋巴積水。方法：暴露耳蝸后在耳蝸上鉆兩小孔，一個(gè)通向鼓階，另外一個(gè)通向底回的前庭階，先通過鼓階的孔向外淋巴液中灌注人工外淋巴液15分鐘，然后灌注含有牛血清蛋白和霍亂毒素的人工外淋巴液。灌注后4小時(shí)通過耳蝸組織切片觀察積水程度，結(jié)果實(shí)驗(yàn)組前庭膜長度增加比（lR／d）較對照組有增加但尚無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Feldman等［11］通過純化的霍亂毒素注射至耳蝸中階75分鐘后觀察到所有豚鼠內(nèi)淋巴液體積明顯增加。此方法制作內(nèi)淋巴積水所需時(shí)間短，成功率較高，但作者未對積水的持續(xù)時(shí)間及轉(zhuǎn)歸進(jìn)行探討。

3 兩期法誘導(dǎo)內(nèi)淋巴積水

Dunnebier［12］自創(chuàng)了兩期法（two－phase）制作豚鼠膜迷路積水模型，即同時(shí)增加內(nèi)淋巴液的產(chǎn)生和減少回流制作。方法：豚鼠麻醉后經(jīng)顱后窩硬膜外徑路暴露內(nèi)淋巴囊，分離乙狀竇與內(nèi)淋巴囊遠(yuǎn)端間的聯(lián)系，使用小塊乳膠片將二者隔開，并用明膠海棉固定，縫合切口。術(shù)后第3周起醛固酮腹腔內(nèi)注射，連續(xù)5天，3周后通過耳蝸切片觀察到33%豚鼠出現(xiàn)中度積水，50%出現(xiàn)重度積水，總成功率為83%。

兩期法制作出的內(nèi)淋巴積水模型是一種動(dòng)態(tài)模型，既有內(nèi)淋巴囊遠(yuǎn)端破壞后內(nèi)淋巴液吸收減少的過程，也有醛固酮誘發(fā)內(nèi)淋巴液分泌量輕度增加的過程，可解釋許多梅尼埃病的癥狀，如梅尼埃病患者聽力的波動(dòng)性變化。手術(shù)導(dǎo)致內(nèi)淋巴功能障礙主要影響耳蝸頂回致低頻聽力下降，醛固酮主要影響底回致高頻聽力下降。該新模型是研究梅尼埃病發(fā)病機(jī)理及治療方法較為理想的模型［12］。

4 免疫法誘導(dǎo)內(nèi)淋巴積水

嚴(yán)格說來，免疫法誘導(dǎo)的內(nèi)淋巴積水也是基于破壞內(nèi)淋巴產(chǎn)生和吸收的動(dòng)態(tài)平衡過程，但因許多學(xué)者提出內(nèi)耳免疫的異常是梅尼埃病的病因之一，故將其單列。

4.1 鑰孔嘁血藍(lán)素免疫誘導(dǎo)致內(nèi)淋巴積水 鑰孔嘁血藍(lán)素（KLH）是一種穩(wěn)定的T細(xì)胞依賴性抗原，具有極強(qiáng)的免疫原性。Tomiyama［13］通過使用KLH中耳免疫誘導(dǎo)豚鼠內(nèi)淋巴積水，探討了內(nèi)淋巴囊的免疫中心作用。方法：豚鼠先通過全身KLH致敏，2周后再行全身加強(qiáng)免疫，之后通過微量移液器將KLH注入內(nèi)淋巴囊行局部免疫。通過組織切片觀察球囊、橢圓囊和耳蝸的內(nèi)淋巴積水程度，耳蝸內(nèi)淋巴積水發(fā)生率在內(nèi)淋巴囊免疫后第二天即達(dá)到100%，并持續(xù)至第七天，隨后積水的發(fā)生率又逐漸下降，在2個(gè)月后內(nèi)淋巴積水發(fā)生率又逐漸升高。

通過KLH致豚鼠內(nèi)淋巴積水的過程相對簡單且成功率非常高，內(nèi)淋巴積水隨時(shí)間變化既可逆的部分，也有不可逆的部分，能夠模擬梅尼埃病的反復(fù)波動(dòng)性發(fā)作，且有前庭紊亂的癥狀，如自發(fā)性眼震和冷熱試驗(yàn)反應(yīng)減弱。缺點(diǎn)是外淋巴液中產(chǎn)生了大量的炎性細(xì)胞，而梅尼埃病患者外淋巴液中沒有。

4.2 辣根過氧化物誘導(dǎo)內(nèi)淋巴積水 1987年Sawada［14］通過使用辣根過氧化物酶（HRP）成功誘導(dǎo)出了內(nèi)淋巴積水模型。方法：首先通過HRP與完全弗氏佐劑混合皮內(nèi)注射免疫豚鼠，1周后通過微量加液器在內(nèi)淋巴囊周圍注射少量的HRP，4～7天后采用同樣的方法行第二次局部加強(qiáng)免疫。通過耳蝸組織切片觀察積水程度，結(jié)果不同時(shí)間段處死的豚鼠中95%觀察到了內(nèi)淋巴積水。此方法制作內(nèi)淋巴積水，步驟簡單，成功率較高；缺點(diǎn)是第一次全身免疫后，未行局部免疫耳亦有可能出現(xiàn)內(nèi)淋巴積水，故實(shí)驗(yàn)耳與對照耳不能選用同只豚鼠。

4.3 其他免疫誘導(dǎo)法 譚長強(qiáng)［15］報(bào)道豚鼠同種內(nèi)耳免疫抗原誘導(dǎo)豚鼠內(nèi)淋巴積水成功率是100%，但翟所強(qiáng)［16］采用類似方法未觀察到耳蝸內(nèi)淋巴積水，故此法穩(wěn)定性差。王紅生［17］報(bào)道酵母多糖活化血清中的補(bǔ)體后誘導(dǎo)出了豚鼠內(nèi)淋巴積水模型，但其成功率僅10%。Matsuoka（2003）通過直接向鼓階注射Ⅱ型膠原CB11肽段單克隆抗體制作出了內(nèi)淋巴積水模型，其成功率是100%。

5 其他

Van Benthem［18］報(bào)道豚鼠腹腔內(nèi)注射尼莫地平，內(nèi)淋巴積水成功率約為40%。Valk［19］通過直接向中階注射人工內(nèi)淋巴液的方法制作內(nèi)淋巴積水模型。Flock［20］、Salt［21］報(bào)道利用噪聲或增加外淋巴靜態(tài)壓誘導(dǎo)出耳蝸內(nèi)淋巴積水。Fukuda等［22］通過豚鼠巨細(xì)胞病毒（GPCMV）注射至內(nèi)淋巴囊誘導(dǎo)出豚鼠內(nèi)淋巴積水，其成功率高達(dá)100%。

將目前制作內(nèi)淋巴積水豚鼠模型方法歸納為表1，可見，雖然內(nèi)淋巴積水的動(dòng)物模型制作方法多種多樣，但尚存在著如下問題：首先，無一種動(dòng)物模型能夠真正吻合梅尼埃病的癥狀、體征、病理生理改變等指標(biāo)，如梅尼埃病患者顳骨解剖中并未發(fā)現(xiàn)阻塞內(nèi)淋巴管和囊的病理改變；無一種模型出現(xiàn)梅尼埃病患者的波動(dòng)性聽力下降，前庭癥狀并未在所有模型動(dòng)物中出現(xiàn)等，故實(shí)驗(yàn)者應(yīng)該根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、結(jié)合造模所需時(shí)間及成功率等因素來選擇不同的造模方法；其次，上述方法確認(rèn)模型制作成功均是處死豚鼠后通過組織切片來判定，至今尚無一種確定活體內(nèi)淋巴積水的特異方法，這樣不利于造模成功后下一步實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行；最后，上述方法對內(nèi)淋巴積水程度的劃分標(biāo)準(zhǔn)不一，有的采用Sperling標(biāo)準(zhǔn)［23］（前庭膜與骨壁有無接觸及前庭膜與螺旋板之間的角度），有的自立標(biāo)準(zhǔn)，這些問題都值得進(jìn)一步深入研究。

表1 內(nèi)淋巴積水豚鼠模型制作方法

1 Kimura RS，Schuknecht HF.Membranous hydrops in the inner ear of the guinea pig after obliteration of the endolymphatic sac［J］.Pract Otorhinolaryngol，1965，27：343.

2 Konishi S，Shea JJ.Experimental endolymphatic hydrops and its relief by interrupting the lateral semicircular duct in guinea pigs［J］.J Laryngol Otol，1975，89：577.

3 王宜南，劉兆華.用計(jì)算機(jī)圖像分析技術(shù)研究膜迷路積水［J］.中華耳鼻咽喉科雜志，1996，31：139.

4 Schuknecht HF，Ruther A.Blockage of longitudinal flow in of the endolymphatic hydrops［J］.Euro Arch Otorhinolaryngol，1991，248：209.

5 Dunnebier EA，Segenhout JM，Wit HP，et al.Endolymphatic hydrops after total dissection or cauterization of the distal portion of the endolymphatic sac［J］.ORL，1996，58：217.

6 Lee KS，Kimura RS.Ischemia of the endolymphatic sac［J］.Acta Otolaryngol，1992，112（Stockh）：658.

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9 蔣子棟，張連山.醛固酮誘發(fā)豚鼠雙耳膜迷路積水［J］.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，24：501.

10 Lohuid Peter JFM，Klis Sjaak FL，Klop Martin C，et al.Signs of endolymphatic hydrops after perilymphatic perfusion of the guinea pig cochlea with cholera toxin：A pharmacological model of acute endolymphatic hydrops［J］.Hear Res，1999，137：103.

11 Feldman AM，Brusilow SW.Effects of cholera toxin on cochlear endolymph production：Model for endolymphatic hydrops［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1976，73：1 761.

12 Dunnebier EA，Segenhout JM，Wit HP，et al.Two－phase endolymphatic hydrops：A new dynamic guinea pig model［J］.Acta Otolaryngol（Stockh），1997，117：13.

13 Tomiyama S.Development of endolymphatic hydrops following immune response in the endolymphatic sac of the guinea pig［J］.Acta otolaryngol，1992，112：470.

14 Sawada I，KiTahara M，Kitajima K，et al.Induction of experimental endolymphatic hydrops by immunologic techniques［J］.Am J Otol，1987，8：330.

15 譚長強(qiáng)，鐘啟明，曹銀成.內(nèi)淋巴囊同種抗原免疫致自身免疫性Meniere病的實(shí)驗(yàn)研究［J］.耳鼻咽喉—頭頸外科，1997，4：47.

16 翟所強(qiáng)，鄒靜，姜泗長，等.同種內(nèi)耳抗原免疫豚鼠致感音神經(jīng)性聾的實(shí)驗(yàn)研究［J］.軍事進(jìn)修學(xué)院學(xué)報(bào)，1994，15：251.

17 王紅生，趙沛英，李志光，等.補(bǔ)體活化與膜迷路積水［J］.中華耳鼻咽喉科雜志，1994，29：371.

18 Van Benthem PPG，Klis SFL，Alberts FWJ，et al.Nimodipine and experimental endolymphatic hydrops.In：Filipo R，Barbara M（eds）.Meniere＇s disease：Perspective in the 90＇s［M］.Amsterdam，New York：Kugler Publ，1994.183～189.

19 Valk WL，Wit HP，Albers FWJ.Changes in distortion of two－tone cochlear microphonic and otoacoustic emission signals during an acute endolymphatic hydrops in the guinea pig［J］.Eur Arch Otorhinolaryngol，2006，263：430.

20 Flock A，F(xiàn)lock B.Hydrops in the cochlea can be induced by sound as well as by static pressure［J］.Hear Res，2000，150：175.

21 Salt AN.Acute endolymphatic hydrops generated by exposure of the ear to nontraumatic low－frequency tones［J］.JARO，2004，5：203.

22 Fukuda S，Keithley EM，Harris JP.The development of endolymphatic hydrops following CMV inoculation of the endolymphatic sac［J］.Laryngoscope，1988，98：439.

23 Sperling NM，Paparella MM，Yoon Th，et al.Symptomatic versus asymptomatic endoulymphatic hydrops：A histopathologic comparison［J］.Laryngoscope，1993，103：277.

（2010－05－20收稿）

（本文編輯 李翠娥）

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劉陽（Email：liuyangdoc＠sina.com）mi［8］報(bào)道采用血管加壓素豚鼠腹腔注射后2小時(shí)即能誘導(dǎo)出急性內(nèi)淋巴積水成功率為40%，積水程度為輕中度；皮下隔日注射共60天能制作出慢性內(nèi)淋巴積水模型，成功率為70%。Taizo［7］采用血管加壓素皮下微泵埋植1周也誘導(dǎo)出了豚鼠內(nèi)淋巴積水模型，成功率為100%。蔣子棟［9］通過連續(xù)5天腹腔注射醛固酮誘導(dǎo)出豚鼠內(nèi)淋巴積水，成功率為100%，并報(bào)道1個(gè)月后誘導(dǎo)出的內(nèi)淋巴積水為輕度，2個(gè)月后則為中重度。