陳秀蘭 秦兆冰 陳曉華

Caspase－9和Livin在中耳膽脂瘤中的表達及意義

陳秀蘭1秦兆冰1陳曉華1

目的 研究凋亡相關蛋白Caspase－9和Livin在中耳膽脂瘤上皮組織中的表達，揭示二者在中耳膽脂瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。方法 采用免疫組化法檢測凋亡促進蛋白Caspase－9和凋亡抵制蛋白Livin在23例中耳膽脂瘤及10例正常外耳道皮膚組織中的表達，對染色結果進行量化處理和統(tǒng)計學分析。結果 Caspase－9和Livin蛋白在中耳膽脂瘤上皮的表達均高于在正常外耳道皮膚中的表達（P＜0.01）；二者在膽脂瘤中的表達呈正相關，相關系數(shù)r＝0.848（P＜0.05）。結論 凋亡促進蛋白Caspase－9和凋亡抑制蛋白Livin在中耳膽脂瘤中的表達同步升高，提示就凋亡過程而言，二者達到了新的平衡。

Caspase－9蛋白； Livin蛋白； 膽脂瘤； 細胞凋亡

中耳膽脂瘤是一種常見病，其主要表現(xiàn)為中耳腔存在大量的增殖角化鱗狀上皮和鄰近骨質的破壞、吸收及角化細胞凋亡，導致腔內(nèi)角化碎屑的堆積。膽脂瘤的發(fā)生、發(fā)展有很多復雜的因素，但其發(fā)病的確切機制目前仍不完全清楚。細胞凋亡在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中主要起負調控作用［1］，近年來國內(nèi)外學者就細胞凋亡調控因子與膽脂瘤發(fā)生發(fā)展的關系進行了研究，如Albino等［2］用特異性的單克隆抗體檢測P53和Ki67在膽脂瘤上皮細胞中的表達，結果表明P53的表達比正常皮膚中的表達高9～20倍，說明P53參與了膽脂瘤上皮細胞的凋亡機制；Olszewska等［3］發(fā)現(xiàn)Apo2.7在膽脂瘤上皮細胞凋亡中起著重要的作用，Kojima等［4］在膽脂瘤中檢測出Bcl－xl能誘導細胞凋亡，說明膽脂瘤細胞凋亡是多因素參與的過程。與正常外耳道皮膚相比，促凋亡蛋白在中耳膽脂瘤中的表達明顯增高，提示膽脂瘤上皮細胞凋亡能力增強，但對凋亡抑制蛋白在中耳膽脂瘤中的表達報道不一致，如關芳靈等［5］報道凋亡抑制蛋白XIAP在中耳膽脂瘤中是低表達或不表達；而李冬等［6］研究示凋亡抑制蛋白Bcl－2在膽脂瘤中的表達水平顯著增高。Caspases蛋白酶解級聯(lián)反應是細胞凋亡的核心機制，是細胞凋亡的中心環(huán)節(jié)和執(zhí)行者［7，8］，Caspase－9是Caspases家族中位于最上游的重要成員，是Caspase系統(tǒng)引起細胞凋亡的最重要的起始因子。凋亡抑制蛋白家族的新成員Livin參與細胞凋亡的調控，促凋亡蛋白Caspase－9和凋亡抑制蛋白Livin在中耳膽脂瘤中的表達情況尚不清楚。為了探討Livin和Caspase－9蛋白在中耳膽脂瘤組織中的作用，本研究對23例中耳膽脂瘤和10例正常外耳道皮膚進行了研究，以進一步探討中耳膽脂瘤的發(fā)病機制。

1 材料與方法

1.1 一般資料 2006年7月～2008年7月鄭州大學第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科中耳膽脂瘤患者手術標本23例，男9例，女14例；年齡10～76歲，平均42±12.01歲，病程6個月～55年，平均5.5± 11.13年。全部患者術前經(jīng)顳骨高分辨CT檢查及術后病理檢查證實為中耳膽脂瘤。取開放式乳突根治手術的中耳膽脂瘤組織和外耳道后壁正常皮膚標本，迅速固定。所有患者均簽署知情同意書。

1.2 免疫組織化學SP法 兔抗人Caspase－9和Livin多克隆抗體均購自美國SANTACRUZ公司，免疫組化SP試劑盒購自北京中杉生物技術有限公司，DAB顯色試劑盒購自北京中杉生物技術有限公司。所有新鮮標本取出后迅速放入10%中性甲醛溶液充分固定，常規(guī)石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片，染色程序按說明書進行［9，10］。用已知的Caspase－9和Livin陽性切片作陽性對照，以PBS代替一抗，作陰性對照。

結果判定：免疫組化陽性表達均為黃棕色顆粒，Caspase－9陽性表達主要定位于細胞漿和核膜，Livin陽性表達主要定位于細胞漿。每張切片于400倍光鏡下選取不相疊的5個視野，測量陽性細胞的平均灰度值，取其均值為該標本測量結果。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件包分析數(shù)據(jù)，Livin和Caspase－9蛋白表達量的差異用t檢驗；用回歸分析法分析兩者的相關性，P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 23份膽脂瘤標本HE染色中均含有角化碎屑或者膽固醇結晶，并都含有膽脂瘤上皮，為復層鱗狀上皮，不同部位鱗狀上皮分層不同；鱗狀上皮可見明顯的局部乳頭狀生長，在乳頭狀生長的部位，鱗狀上皮分層尤其不規(guī)則。

2.2 Caspase－9和Livin蛋白在膽脂瘤和正常皮膚中的表達 Caspase－9蛋白在中耳膽脂瘤上皮細胞由基底層向外至角質層細胞中均有不同程度染色，但主要分布在顆粒層和棘層，表達密集（圖1）；在外耳道正常皮膚中的表達雖然也分布在顆粒層和棘層，但表達稀疏（圖2）；Livin蛋白在中耳膽脂瘤上皮細胞由基底層向外至角質層細胞中均有不同程度染色（圖3）；在外耳道正常皮膚中的表達主要分布在基底層和基底上層，表達稀疏（圖4）；Caspase－9和Livin蛋白在中耳膽脂瘤上皮的表達比在正常外耳道皮膚中的表達范圍廣，且表達水平也明顯增強，陽性平均灰度值比較見表1。

圖1 Caspase－9蛋白在膽脂瘤中的表達（SP×400）圖3 Livin蛋白在膽脂瘤中的表達（SP×400）

表1 膽脂瘤和外耳道正常皮膚中Caspase－9蛋白和Livin蛋白表達灰度值（ˉx±s）

2.3 Caspase－9和Livin蛋白表達相關性研究Caspase－9和Livin蛋白在膽脂瘤中的表達呈正相關，r＝0.848（P＜0.05）。

3 討論

圖2 Caspase－9蛋白在正常皮膚中的表達（SP×400）圖4 Livin蛋白在正常皮膚中的表達（SP×400）

Livin是新發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP）家族成員之一，與Survivin具有同源性。它含有一個IAP家族特征性的桿狀病毒IAP重復序列（baculoviral IAP repeat，BIR）結構域和羧基端的環(huán)狀指樣結構區(qū)域（RIAG Zinc－finger domain）。Livin在正常成人的大多數(shù)組織中不表達［11］，在表皮、淋巴結、脾臟和黑色素細胞中弱表達，在胎兒的腦、胸腺、腎臟和肝等組織中高表達［12］。Livin主要通過和Caspase蛋白結合抑制其級聯(lián)激活反應而發(fā)揮抗凋亡作用。Nachmias等［13］的研究發(fā)現(xiàn)，Livin可以和Caspase－9結合，在凋亡的起始階段起抗凋亡作用。

本研究顯示，Caspase－9蛋白在中耳膽脂瘤上皮的表達主要在顆粒層和棘層，表達密集，在正常外耳道皮膚中的表達主要位于顆粒層，表達稀疏，二者之間的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），與Miyao等［14］研究結果Caspase－3和Caspase－8在中耳膽脂瘤中高表達相符。說明膽脂瘤上皮細胞有很強的凋亡能力，這與腫瘤細胞的無限制的增殖并且能抵御凋亡的能力完全不同［15］。促凋亡蛋白Caspase－9在中耳膽脂瘤中的高表達，說明Caspase－9在膽脂瘤上皮的細胞凋亡中起著很重要的作用，使其凋亡能力增強，造成大量的膽脂瘤角質細胞堆積，并使快速增殖的膽脂瘤細胞受到抑制，說明Caspase－9在中耳膽脂瘤的凋亡機制中發(fā)揮重要的作用。。Livin蛋白在中耳膽脂瘤上皮的表達比正常外耳道皮膚中的表達范圍廣，且表達水平也明顯增強，二者之間的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），與Park等［16］研究結果Survivin在中耳膽脂瘤中高表達相符。凋亡抑制蛋白Livin在膽脂瘤組織中異常表達，說明Livin參與了膽脂瘤上皮的凋亡調控過程，在膽脂瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用。

本研究顯示，促凋亡蛋白Caspase－9和抑制凋亡蛋白Livin在膽脂瘤中的表達呈正相關，因此可以認為，由于Caspase－9和Livin蛋白的相互作用，使膽脂瘤上皮細胞凋亡保持相對平衡狀態(tài)。而Caspase－9蛋白低表達，細胞凋亡受抑制，二者呈負相關。減少Livin的產(chǎn)生可能會有效減少中耳膽脂瘤細胞凋亡的抑制，這樣，也許就為我們提供了另一種治療膽脂瘤型中耳炎的新途徑和新思路，但Livin參與中耳膽脂瘤細胞凋亡具體機制還有待研究。

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2 Albino AP，Reed JA，Bogdany JK，et al.expression of P53 protein in human middle ear cholesteatomas：pathogenetic impications［J］.Am J Otol，1998，19：30.

3 Olszewska E，Chodynicki S，Chyczewsk L.Apoptosis in the pathogenesis of cholesteatoma in adults［J］.Eur Arch Otorhinolaryngol，2006，263：409.

4 Kojima H，Miyazaki H，Tanaka Y，et al.Role of Bcl－xl protein in differentiation and apoptosis of human middle ear cholesteatoma epithelium［J］.Arch Otolaryngol Head Neck Surg，1999，125：738.

5 關芳靈，馬敏，尚麗芳，等.X連鎖凋亡抑制蛋白在膽脂瘤中的表達及其與細胞凋亡的關系［J］.山西醫(yī)藥雜志，2008，37：492.

6 李冬，黃芳，龔樹生，等.凋亡抑制蛋白survivin及Bcl－2在中耳膽脂瘤上皮中的表達及意義［J］.中國耳鼻咽喉顱底外科雜志，2006，12：334.

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9 Hamzei M，Ventriglia G，Hagnia M，et al.Osteoclast stimulating and differentiating factors in human cholesteatoma［J］.Laryngoscope，2003，113：436.

10 Jeong JH，Park CW，Tae K，et al.Expression of RANKL and OPG in middle ear cholesteatoma tissue［J］.Laryngoscope，2006，116：1 180.

11 Lin JH，Deng G，Huang Q，et al.KIAP，a novel member of the inhibitor of apoptosis protein family［J］.Biochem Biophys Res Commun，2000，279：820.

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15 余其林，金康業(yè).中耳膽脂瘤上皮細胞增生與凋亡狀態(tài)的研究［J］.臨床耳鼻咽喉科雜志，2001，15：450.

16 Park HR，Min SK，Min K，et al.Increased expression of P63 and survivin in cholesteatomas［J］.Acta Otolaryngol，2009，129：268.

（2010－05－10收稿）

（本文編輯 雷培香）

Expression and Significance of Caspase－9 and Livin in the MiddIe Ear ChoIesteatoma

Chen XiuIan，Qin ZhaoBin，Chen Xiaohua
（Department of OtorhinoIaryngoIogy，the First AffiIiated HospitaI of Zhengzhou University，Zhengzhou，450052，China）

Objective To investigate the effect of caspase－9 apoptosis protein and the inhibitor of apoptosis protein livin in the middle ear cholesteatoma.Methods The expressions of caspase－9 and livin in 23 cholesteatoma and 10 normal cases of exteral meatal skin were studied with immunohistochemistry.Semiquantitative analysis was used for comparision and statistical analysis.ResuIts ①The gray values of caspase－9 and livin in the cholesteatoma were signifincantly higher than in the exteral meatal skin（P＜0.05）.②Caspase－9 and livin had both positive staining in 14 cases，while caspase－9 and livin had both negative staining in 4 cases，and livin had positive staining but Caspase－9 staining was absent in 1 case.Caspase－9 had positive staining but livin staining was absent in 4 case of the corelation analysis（P＜0.05）.ConcIusion The expressions of caspase－9 and livin in the middle ear cholesteatoma made the apoptosis reach a new balance，which was different from those in maligant tumors.

Caspase－9； Livin； Cholesteatoma； Apoptosis

10.3969／j.issn.1006－7299.2011.01.014

R764.2

A

1006－7299（2011）01－0044－03

1 鄭州大學第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科（鄭州 450052）

陳秀蘭，女，河南人，主治醫(yī)師，主要研究方向為聽力學。

秦兆冰（Email：qzb＠zzu.edu.cn）