李瑞杰 白黎明 張嘵雙

(河北省新樂市中醫(yī)院中風(fēng)病科，河北 新樂 050700)

地黃飲子對(duì)慢性腦低灌注大鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬基質(zhì)金屬蛋白酶-2、基質(zhì)金屬蛋白酶-9的影響※

李瑞杰 白黎明1張嘵雙2

(河北省新樂市中醫(yī)院中風(fēng)病科，河北 新樂 050700)

目的 探討地黃飲子對(duì)慢性腦低灌注大鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)的影響。方法 將50只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型對(duì)照組、地黃飲子大劑量組、地黃飲子小劑量組及養(yǎng)血清腦顆粒組，每組各10只。采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎制作大鼠慢性腦缺血模型，假手術(shù)組同樣分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，但不予結(jié)扎。每日灌胃給藥1次，給藥容積10 mL/kg，地黃飲子大、小劑量組分別為20、10 g/kg，養(yǎng)血清腦顆粒為2 g/kg，連續(xù)8周。假手術(shù)組和模型對(duì)照組灌胃等容積蒸餾水。采用Morris水迷宮法進(jìn)行大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的測(cè)定。并免疫組織化學(xué)法測(cè)定MMP-2、MMP-9表達(dá)。結(jié)果 以大鼠逃避潛伏期和跨越平臺(tái)次數(shù)代表學(xué)習(xí)記憶能力，逃避潛伏期越短，跨越平臺(tái)次數(shù)越多，記憶能力越強(qiáng)。模型對(duì)照組逃避潛伏期較假手術(shù)組長(P＜0.05)，跨越平臺(tái)次數(shù)較假手術(shù)組少(P＜0.05)，說明結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈模型可導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能下降。與模型對(duì)照組比較，地黃飲子組、養(yǎng)血清腦顆粒組逃避潛伏期均縮短(P＜0.05，P＜0.01)，跨越平臺(tái)次數(shù)均增加(P＜0.05，P＜0.01)。與地黃飲子小劑量組比較，地黃飲子大劑量組、養(yǎng)血清腦顆粒組逃避潛伏期縮短(P＜0.05)，跨越平臺(tái)次數(shù)增加(P＜0.05)。模型對(duì)照組海馬組織MMP-2、MMP-9表達(dá)較假手術(shù)組增高(P＜0.01)。地黃飲子組、養(yǎng)血清腦顆粒組海馬組織MMP-2、MMP-9表達(dá)均低于模型對(duì)照組(P＜0.05，P＜0.01)。地黃飲子大劑量組海馬組織MMP-2、MMP-9表達(dá)低于地黃飲子小劑量組(P＜0.05)，養(yǎng)血清腦顆粒組海馬組織MMP-2、MMP-9表達(dá)低于地黃飲子大劑量組(P＜0.05)。結(jié)論 地黃飲子能改善慢性低灌注大鼠學(xué)習(xí)記憶力功能，可能與抑制炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡有關(guān)。

地黃飲子;大鼠，SD;海馬，化學(xué);疾病模型，動(dòng)物;顱內(nèi)動(dòng)靜脈畸形，代謝;慢性病;腦缺血，代謝;再灌注損傷，代謝;基質(zhì)金屬蛋白酶2;基質(zhì)金屬蛋白酶9

慢性腦低灌注是各種原因引起的長期腦灌注不足，促使腦發(fā)生一系列病理生理改變，臨床主要表現(xiàn)為進(jìn)行性的學(xué)習(xí)、記憶等認(rèn)知功能障礙，是血管性癡呆、初老期癡呆(Alzheimer病)和皮層下動(dòng)脈硬化性腦病(Bingswanger)等多種疾病發(fā)展過程中的一個(gè)共同病理過程。隨著年齡的增長，全腦或局部腦區(qū)慢性低灌注狀態(tài)成為一種較常見的狀態(tài)，在臨床中腦低灌注狀態(tài)得到了越來越多的認(rèn)識(shí)和重視。地黃飲子具有滋腎陰、補(bǔ)腎陽、化痰開竅的功能，臨床上觀察到地黃飲子能夠有效改善患者慢性腦血流灌注不足的癥狀。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察地黃飲子對(duì)大鼠慢性腦低灌注的作用效果及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量(250±20)g，SPF級(jí)，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(陜)2007-001。飼養(yǎng)于陜西中醫(yī)學(xué)院中藥藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室，溫度25℃，濕度45%。自由飲水，每日光照4 h。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品及試劑 地黃飲子水煎液由陜西中醫(yī)學(xué)院中藥藥理研究室制備，地黃飲子按原方比例(熟地黃18 g，巴戟天、山茱萸、石斛、肉蓯蓉各 9 g，炮附子、五味子、肉桂、茯苓、麥門冬、石菖蒲、遠(yuǎn)志各6 g，薄荷、生姜、大棗各3 g)配伍，加10倍量水浸泡2 h，煎煮40 min后過濾煎液，再加8倍量水煎煮40 min，過濾煎液，合并2次濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至分別含生藥2 g/mL和1 g/mL的藥液后，無菌條件裝瓶，置4℃冰箱備用。養(yǎng)血清腦顆粒(天津天士力制藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字Z10960082)?；|(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 Morris水迷宮由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院治療所生產(chǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組 50只SD大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型對(duì)照組、地黃飲子大劑量組、地黃飲子小劑量組和養(yǎng)血清腦顆粒組，每組各10只。

1.2.2 模型制備 術(shù)前12 h禁食，4 h禁水。用水合氯醛(青島宇龍海藻有限公司，國藥準(zhǔn)字 H37022673)350 mg/kg腹腔注射麻醉，仰臥位固定，頸正中去毛，碘伏消毒，頸正中切開，仔細(xì)分離出雙側(cè)頸總動(dòng)脈并結(jié)扎，假手術(shù)組同樣分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，但不予結(jié)扎?？p合切口后回籠飼養(yǎng)，青霉素抗感染4 d。

1.2.3 給藥方法 每日灌胃給藥1次，給藥容積10 mL/kg，地黃飲子大、小劑量組分別為20、10 g/kg，養(yǎng)血清腦顆粒為2 g/kg，連續(xù)8周。假手術(shù)組和模型對(duì)照組灌胃等容積蒸餾水。

1.3 觀察指標(biāo)及方法

1.3.1 于給藥后4、8周采用Morris水迷宮法進(jìn)行大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的測(cè)定。①定位航行試驗(yàn):歷時(shí)4 d，每日上、下午各2次，將大鼠面向池壁分別從4個(gè)入水點(diǎn)放入水中，記錄其在3 min內(nèi)尋找到并爬上平臺(tái)的時(shí)間即逃避潛伏期。如果大鼠在3 min未找到平臺(tái)，則由實(shí)驗(yàn)者用手牽引其至平臺(tái)上，讓大鼠停留10 s再放回籠中，潛伏期記為最高分180 s。分別在給藥后4、8周重新進(jìn)行游泳實(shí)驗(yàn)，大鼠每次在3 min內(nèi)尋找到并爬上平臺(tái)的時(shí)間為大鼠的記憶成績，每日2次，連續(xù)4 d，計(jì)算平均成績。②空間探索實(shí)驗(yàn):第5 d撤除平臺(tái)，將大鼠任選1個(gè)入水點(diǎn)放入水中，測(cè)其2 min內(nèi)跨越原平臺(tái)所在位置的次數(shù)。上、下午各1次，計(jì)算平均成績。

1.3.2 以大鼠逃避潛伏期和跨越平臺(tái)次數(shù)代表學(xué)習(xí)記憶能力，逃避潛伏期越短，跨越平臺(tái)次數(shù)越多，記憶能力越強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后大鼠經(jīng)心臟灌注固定后取腦，固定，梯度酒精中脫水，脫水后浸蠟包埋，行冠狀位連續(xù)切片，并將切片粘于多聚賴氨酸處理的載玻片上，烘干，免疫組織化學(xué)法測(cè)定 MMP-2、MMP-9。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用方差分析，組間采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 地黃飲子對(duì)慢性腦低灌注大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響見表1。

表1 地黃飲子對(duì)慢性腦低灌注大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響±s

表1 地黃飲子對(duì)慢性腦低灌注大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響±s

與假手術(shù)組比較，*P ＜0.05;與模型對(duì)照組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01;與地黃飲子小劑量組比較，#P ＜0.05

組 別 n 劑量(g/kg) 逃避潛伏期(s)跨越平臺(tái)次數(shù)(次)4周 8周4周 8周假手術(shù)組 10 - 17.63 ±3.67 16.33 ±2.44 7.40 ±1.71 7.70 ±1.64模型對(duì)照組 10 - 47.30 ±7.66* 53.50 ±3.34* 3.00 ±1.41* 2.50 ±1.27*地黃飲子小劑量組 10 10 39.00±8.47△ 44.50±7.41△△ 4.30±1.16△ 4.00±1.05△地黃飲子大劑量組 10 20 34.30±7.35△△# 36.30±8.12△△# 4.80±1.23△# 4.50±1.2△△#養(yǎng)血清腦顆粒組 10 2 31.60±8.02△△# 34.60±9.73△△# 5.00±1.49△# 4.70±1.42△△#

由表1可見，模型對(duì)照組逃避潛伏期較假手術(shù)組長(P＜0.05)，跨越平臺(tái)次數(shù)較假手術(shù)組少(P＜0.05)，說明結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈模型可導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能下降。與模型對(duì)照組比較，地黃飲子組、養(yǎng)血清腦顆粒組逃避潛伏期均縮短(P＜0.05，P＜0.01)，跨越平臺(tái)次數(shù)均增加(P＜0.05，P＜0.01)。與地黃飲子小劑量組比較，地黃飲子大劑量組、養(yǎng)血清腦顆粒組逃避潛伏期縮短(P＜0.05)，跨越平臺(tái)次數(shù)增加(P＜0.05)。

2.2 地黃飲子對(duì)慢性腦低灌注大鼠海馬組織MMP-2、MMP-9的影響 見表2。

表2 地黃飲子對(duì)慢性腦低灌注大鼠海馬組織MMP-2、MMP-9的影響±s

表2 地黃飲子對(duì)慢性腦低灌注大鼠海馬組織MMP-2、MMP-9的影響±s

與假手術(shù)組比較，*P ＜0.01;與模型對(duì)照組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01;與地黃飲子小劑量組比較，#P ＜0.05;與地黃飲子大劑量組比較，☆P ＜0.05

MMP-2 MMP-9假手術(shù)組 10 —組 別 n劑量(g/kg)2.92 ±0.79 2.25 ±0.87模型對(duì)照組 10 — 21.33±2.10* 21.58±2.11*地黃飲子小劑量組 10 10 19.58±2.50△ 19.75±1.76△地黃飲子大劑量組 10 20 17.67 ±1.92△△# 17.92 ±2.47△△#養(yǎng)血清腦顆粒組 10 2 15.75±2.01△△☆ 16.42±2.07△△☆

由表2可見，模型對(duì)照組海馬組織MMP-2、MMP-9表達(dá)較假手術(shù)組增高 (P＜0.01)。地黃飲子組、養(yǎng)血清腦顆粒組海馬組織MMP-2、MMP-9表達(dá)均低于模型對(duì)照組(P＜0.05，P＜0.01)。地黃飲子大劑量組海馬組織MMP-2、MMP-9表達(dá)低于地黃飲子小劑量組(P＜0.05)。養(yǎng)血清腦顆粒組海馬組織MMP-2、MMP-9表達(dá)低于地黃飲子大劑量組(P＜0.05)。

3 討論

全腦或局部腦區(qū)慢性低灌注是目前認(rèn)為有認(rèn)知功能障礙的老年人中比較常見的一種病理生理改變。很多資料顯示在低灌注狀態(tài)下，認(rèn)知功能可發(fā)生減退［1］。有學(xué)者永久性結(jié)扎大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈制作出慢性腦缺血的動(dòng)物模型，經(jīng)證實(shí)這一模型能使Wistar大鼠術(shù)后數(shù)月腦血流仍明顯下降，不同腦區(qū)腦血流下降的程度不同。同時(shí)，由于大鼠Willis環(huán)發(fā)達(dá)，代償好，并沒有導(dǎo)致任何一個(gè)腦區(qū)血流灌注完全停止，接近臨床慢性腦低灌注的發(fā)病機(jī)制，是目前普遍認(rèn)同的用于慢性腦低灌注研究的動(dòng)物模型［2］。海馬、前額葉、顳葉及大腦皮層的神經(jīng)元對(duì)缺血十分敏感，而這些區(qū)域神經(jīng)元功能和結(jié)構(gòu)的損害會(huì)造成與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)紊亂［3］?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一組鈣離子和鋅離子依賴的金屬蛋白內(nèi)切酶家族，可以降解絕大部分細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分［4］。近年來，研究發(fā)現(xiàn)MMPs，尤其是MMP-9可以通過降解血腦屏障基底膜及緊密連接，參與腦缺血后血腦屏障的破壞［5］。血腦屏障的功能損害，不僅使水、電解質(zhì)外流，也使大量的蛋白質(zhì)外流，最終形成血管源性腦水腫，神經(jīng)元損壞。同時(shí)活化的白細(xì)胞通過破壞了的血腦屏障滲出到腦組織內(nèi)，釋放許多細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)，加速神經(jīng)元的死亡，加重缺血性腦損害［6］。另外，目前有研究表明MMP-9還與細(xì)胞凋亡有關(guān)［7］。

地黃飲子出自《黃帝素問宣明論方》，由熟地黃、巴戟天、山茱萸、石斛、肉蓯蓉、五味子等組成，具有滋腎陰、補(bǔ)腎陽、化痰開竅的功能。本研究結(jié)果表明，雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性結(jié)扎可導(dǎo)致腦低灌注大鼠學(xué)習(xí)記憶能力減退，炎性介質(zhì)的釋放，加速細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)提示地黃飲子能明顯改善慢性腦低灌注大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，減低慢性腦低灌注大鼠MMP-2、MMP-9的表達(dá)。提示地黃飲子具有一定保護(hù)神經(jīng)元免受損傷，從而預(yù)防改善記憶減退的作用。此機(jī)制可闡釋該方的滋腎陰、補(bǔ)腎陽、化痰開竅的功效。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)發(fā)現(xiàn)在減低MMP-2、MMP-9的表達(dá)上地黃飲子大、小劑量組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，說明在改善慢性腦低灌注大鼠學(xué)習(xí)記憶能力、減低慢性腦低灌注上可能存在量效關(guān)系，且影響是多方面的。養(yǎng)血清腦顆粒是以宋代《太平惠民和劑局方》的四物湯為基礎(chǔ)加味并采用最新工藝研制而成的標(biāo)本兼治的制劑，在臨床上廣泛應(yīng)用于因慢性腦供血不足(CCCI)引起的頭暈、頭痛等，故本實(shí)驗(yàn)選用養(yǎng)血清腦顆粒作為陽性對(duì)照藥物，本實(shí)驗(yàn)中將養(yǎng)血清腦顆粒組與地黃飲子大劑量組進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)兩者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，養(yǎng)血清腦顆粒組優(yōu)于地黃飲子原方組，說明在臨床應(yīng)用上地黃飲子原方應(yīng)進(jìn)一步改進(jìn)研究，以待提高。

［1］毛玲，查運(yùn)紅，黃敬，等.慢性全腦低灌注大鼠血腦屏障的改變及MMP-9表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究［J］.卒中與神經(jīng)疾病，2007，14(1):32-36.

［2］趙玲，劉麗，李雅莉，等.慢性腦低灌注狀態(tài)對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶功能及腦組織自由基代謝的影響［J］.中國行為醫(yī)學(xué)科學(xué)，2005，14(11):961-963.

［3］劉匯波，葉翠飛，李斌，等.雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶功能和海馬組織形態(tài)學(xué)的影響［J］.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，1998，18(4):54-58.

［4］肖智勇，陳勁草，于加省.基質(zhì)金屬蛋白酶-9和血管內(nèi)皮生長因子在顱內(nèi)動(dòng)脈瘤中的表達(dá)［J］.卒中與神經(jīng)疾病，2006，13(2):90-92.

［5］王靜云，王國峰，趙仁亮.腦缺血預(yù)處理對(duì)腦缺血再灌注大鼠血腦屏障通透性和基質(zhì)金屬蛋白酶-9表達(dá)的影響［J］.國際腦血管病雜志，2010，(9):668-673.

［6］毛玲，查運(yùn)紅.基質(zhì)金屬蛋白酶-9與腦缺血血腦屏障損傷的關(guān)系［J］.國際神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)外科學(xué)雜志，2006，33(1):96-98.

［7］王知非，廖達(dá)光，吳浩，等.大鼠彌漫性腦損傷中基質(zhì)金屬蛋白酶-9通過激活鈣蛋白酶導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2010，(9):1336-1338.

Effect of Dihuangyinzi on learning and memory and MMP-2，MMP-9 of hippocampal matrix in rats with chronic cerebral hypoperfusion

LI Ruijie*，BAI Liming，ZHANG Xiaoshuang.*Department of Stroke，Xinle City Hospital of Hebei Province，Hebei Province，Xinle050700

ObjectiveTo observe the effect of Dihuangyinzi on learning and memory and MMP-2，MMP-9 of hippocampal matrix in rats with chronic cerebral hypoperfusion.MethodsFifty SD rats were randomly divided into sham operation group，model control group，Dihuangyinzi high-dose group，low-dose group Dihuangyinzi and Yangxueqingnao granule group(n=10).Rat model of chronic cerebral ischemia was established by the method of bilateral carotid artery ligation.Sham group

the same separation of bilateral common carotid artery，but not ligation，Dihuangyinzi high-，low-dose group were given 20，10 g/kg by gavage once a day，dose volume of 10 mL/kg.Yangxueqingnao granule received 2 g/kg，for 8 weeks.Sham operation group and model control group was given an equal volume of distilled water.Learning and memory function in rats were measured by Morris water maze.ResultsEscape latency of model control group was longer than that in the sham operation group(P＜0.05)，frequency of cross-platform was less than that in the sham group(P＜0.05).Escape latency in Dihuangyinzi highdose group，Dihuangyinzi low-dose group and Yangx-ueqingnao granule group were decreased in comparison with that in model control group(P＜0.05，P＜0.01).The frequency of cross-platform in these three groups were increased(P＜0.05，P＜0.01).Escape latency in Dihuangyinzi high-dose group and Yangxueqingnao granule group were decreased in comparison with that in low-dose group Dihuangyinzi group(P＜0.05).The frequency of cross-platform in these two groups were increased compared with that in Dihuangyinzi low-dose group(P＜0.05).MMP-2 and MMP-9 expression of hippocampus in model control group were increased in comparison with those in sham group(P＜0.01).MMP-2 and MMP-9 expression of hippocampus in Dihuangyinzi high-dose group，Dihuangyinzi low-dose group and Yangxueqingnao granule group were lower than those in model control group(P＜0.05，P＜0.01).MMP-2 and MMP-9 expression of hippocampus in Dihuangyinzi high-dose group and Yangxueqingnao granule group were lower than those in Dihuangyinzi low-dose group(P＜0.05).MMP-2 and MMP-9 expression of hippocampus in Yangxueqingnao granule group were lower than those in Dihuangyinzi high-dose group(P＜0.05).ConclusionDihuangyinzi can improve learning and memory in rat with chronic cerebral hypoperfusion，it may be related to inhibition of inflammation and apoptosis.

Rat;SD;Hippocampus;Chemistry;Disease model;Animal;Intracranial arteriovenous malformation;Metabolism;Chronic disease;Cerebral ischemia;Reperfusion injury;Matrix metalloproteinase

R289.5;R-331;R743.4;R977.6

A

1002-2619(2011)10-1551-04

※項(xiàng)目來源:陜西省教育廳科學(xué)研究計(jì)劃(2010JK488);陜西中醫(yī)學(xué)院校級(jí)課題(2009XJ-26);陜西省痰瘀論治中醫(yī)腦病重點(diǎn)研究室重點(diǎn)項(xiàng)目

1 陜西中醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院臨床教研室，陜西 咸陽 712046

2 陜西中醫(yī)學(xué)院藥理教研室，陜西 咸陽 712046

李瑞杰(1979—)，男，主治中醫(yī)師，碩士。從事中西醫(yī)結(jié)合治療腦血管病臨床和實(shí)驗(yàn)研究工作。

2011-06-20)