姬軍風(fēng) 關(guān)建軍 吳世衛(wèi)

(陜西中醫(yī)學(xué)院解剖教研室，陜西 咸陽 712046)

針刺益氣活血法對血管性癡呆大鼠超氧化物歧化酶及丙二醛的影響※

姬軍風(fēng) 關(guān)建軍 吳世衛(wèi)

(陜西中醫(yī)學(xué)院解剖教研室，陜西 咸陽 712046)

目的 探討針刺益氣活血法對血管性癡呆(VD)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和腦海馬組織中超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量的影響。方法 將SD大鼠30只隨機(jī)分為模型組、治療組及對照組，每組各10只。模型組及治療組采用改良的Pulsinelklli-4血管阻斷法建立VD大鼠模型;治療組造模后選用百會、膈俞、氣海、三陰交、膻中組成益氣活血方針刺治療;未造模大鼠作為對照組。觀察各組大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)各項(xiàng)指標(biāo)及腦海馬組織SOD活性和MDA含量的變化。結(jié)果 模型組大鼠每日逃避潛伏期均明顯長于對照組(P＜0.01)，治療組大鼠逃避潛伏期較模型組明顯縮短(P＜0.01)，但仍長于對照組(P＜0.01)。3組大鼠在訓(xùn)練第5 d后通過原平臺位置的次數(shù)，治療組大鼠多于模型組(P＜0.01)，但低于對照組(P＜0.05)。模型組腦海馬組織中的SOD活性較對照組明顯降低，而MDA含量明顯增高(P＜0.01)。治療組與模型組比較能明顯升高SOD活性，降低MDA含量(P＜0.01)，并且治療組升高的SOD活性、降低的MDA含量已接近正常組(P＞0.05)。結(jié)論 針刺益氣活血法治療血管性癡呆的作用可能與其改善VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，顯著提高腦海馬組織中SOD活性及降低MDA含量有關(guān)。

超氧化物歧化酶;丙二醛;癡呆，血管性;針灸療法

血管性癡呆(vascular dementia，VD)是因腦血管疾病所致的一種獲得性持續(xù)性智能損害綜合征，屬中醫(yī)學(xué)呆病、健忘等范疇。我們通過觀察針刺對血管性癡呆大鼠行為學(xué)改變及腦海馬組織中的超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量等指標(biāo)的影響，以期探討對血管性癡呆的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 選用SD大鼠30只，雌雄各半，體質(zhì)量220～260 g，中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物編號:08046，許可證號:SCXK(軍)2007—007。

1.2 主要儀器及試劑 HDW-60型電灼治療儀，成都航天產(chǎn)業(yè)開發(fā)有限公司制造。Morris水迷宮DMS320，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所制造。KDC-40低速離心機(jī)，科大創(chuàng)新中佳公司制造。723分光光度計(jì)，上海光譜有限公司制造。SOD試劑盒(批號:20080621)、MDA試劑盒(批號:20080511)和考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒(批號:20080801)均由南京建成生物工程研究所提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物模型制備 查隨機(jī)表對大鼠進(jìn)行分組，每組10只，模型組和治療組采用改良Pulsinelli-4血管阻斷法建立大鼠VD模型［1］。用戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，固定，暴露第1頸椎橫突翼小孔，用直徑0.5 mm電凝針灼燒雙側(cè)翼小孔內(nèi)的椎動(dòng)脈，造成永久性閉塞。24 h后，乙醚淺麻醉，切開腹側(cè)頸部正中皮膚，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，用微動(dòng)脈夾可逆性夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈5 min，共夾閉3次，每次間隔1 h，術(shù)后飼養(yǎng)觀察1個(gè)月。對照組10只大鼠行同樣手術(shù)但不灼燒椎動(dòng)脈，不夾閉頸總動(dòng)脈。

1.3.2 針刺 治療組根據(jù)益氣活血法選取以下穴位:百會、膻中、氣海、膈俞(雙側(cè))、三陰交(雙側(cè))。參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》［2］并結(jié)合人體穴位定位取穴。針刺前將大鼠固定，百會、膻中平刺5 mm;氣海、膈俞、三陰交直刺5 mm，捻針1 min，留針10 min，反復(fù)3次，共30 d。模型組和對照組大鼠，每日同時(shí)進(jìn)行抓取固定，共30 d，但不進(jìn)行針刺治療。

1.3.3 學(xué)習(xí)記憶能力檢測 Morris水迷宮法:水迷宮的水為直徑150 cm，深50 cm，水深30 cm的圓形水池，水溫(23±2)℃。水面覆蓋一層泡沫塑料屑，在池壁上4個(gè)等距離點(diǎn)把水池分為4個(gè)象限，任選一象限在其離池壁30 cm處放一直徑為9 cm的圓形無色透明平臺，并使其低于水面1 cm。整個(gè)實(shí)驗(yàn)階段迷宮外參照物保持不變，避免光線、時(shí)間等外界條件的干擾。各組大鼠在造模30 d后進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶功能測試，包括:①空間學(xué)習(xí)記憶定位航行試驗(yàn):將大鼠面向池壁隨機(jī)分別從4個(gè)象限輕輕放入水中，避免老鼠嗆水、受驚，觀察記錄大鼠尋找并爬上平臺的路徑和所需時(shí)間(如果120 s內(nèi)找不到平臺，記錄潛伏期為120 s)，找到平臺后，在上面休息60 s，再次將大鼠按序由下一象限放入池中進(jìn)行測試，并計(jì)算出每只大鼠在4個(gè)象限時(shí)間總和。每日測試均在當(dāng)日固定時(shí)間進(jìn)行4次，連續(xù)5 d。②空間搜索試驗(yàn):第5 d第4次測試結(jié)束后，撤出平臺，大鼠在120 s內(nèi)在各象限的游泳的路徑及通過原放平臺位置的次數(shù)。

1.3.4 標(biāo)本采集 水迷宮行為學(xué)檢測完畢后，用10%水合氯醛腹腔麻醉，將各組動(dòng)物快速斷頭處死。冰盤上快速剖取腦組織，依照《大白鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)解剖學(xué)基礎(chǔ)》［3］描述采集100 mg左右海馬組織，按組織質(zhì)量比為1∶9加預(yù)冷的0.9%氯化鈉注射液制成10%的組織勻漿，4℃3 500 r/min離心10 min，取上清液，儲存-20℃冰箱備用，用于檢測組織SOD活性和MDA含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，各組間變量比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠Morris水迷宮檢測試驗(yàn)逃避潛伏期時(shí)間比較 見表1。

表1 各組大鼠Morris水迷宮檢測試驗(yàn)逃避潛伏期時(shí)間比較s，±s

表1 各組大鼠Morris水迷宮檢測試驗(yàn)逃避潛伏期時(shí)間比較s，±s

與對照組同期比較，*P ＜0.01;與模型組同期比較，△P ＜0.01

組 別 n 第1 d 第2 d 第3 d 第4 d 第5 d對照組 10 38.72 ±15.37 24.56 ±9.87 18.51 ±10.26 14.87±8.92 14.42 ±10.62模型組 10 103.23 ±21.65* 96.23 ±26.36* 93.39 ±19.74* 89.61 ±17.58* 86.91 ±14.62*治療組 10 87.42 ±17.54＊△ 51.32±12.68＊△ 46.91±11.39＊△ 42.78±9.86＊△ 43.67±10.38＊△

由表1可見，模型組大鼠每日逃避潛伏期均明顯長于對照組(P＜0.01)，治療組大鼠逃避潛伏期較模型組明顯縮短(P＜0.01)，但仍長于對照組(P＜0.01)。

2.2 各組大鼠120 s內(nèi)通過原平臺位置次數(shù)比較 見表2。

表2 各組大鼠120 s內(nèi)通過原平臺位置次數(shù)比較±s

表2 各組大鼠120 s內(nèi)通過原平臺位置次數(shù)比較±s

與對照組比較，*P ＜0.05;與模型組比較，△P ＜0.01

組 別 n 通過平臺次數(shù)對照組10 14.61 ±3.42模型組 10 5.49 ±1.56治療組 10 12.38 ±3.67＊△

由表2可見，3組大鼠在測試第5 d后通過原平臺位置的次數(shù)，治療組大鼠多于模型組(P＜0.01)，但低于對照組(P＜0.05)。

2.3 各組海馬組織中的SOD活性及MDA含量比較 見表3。

表3 各組海馬組織中的SOD活性及MDA含量變化比較±s

表3 各組海馬組織中的SOD活性及MDA含量變化比較±s

與模型組比較，*P ＜0.01

組 別 n SOD(U/mg·prot) MDA(nmol/mg·prot)對照組 10 191.84 ±25.37* 3.01 ±0.38*模型組 10 110.57 ±21.98 5.80 ±0.91針刺組 10 188.79 ±33.31* 3.47 ± .62*

由表3可見，模型組海馬組織中的SOD活性較對照組明顯降低，而MDA含量明顯增高(P＜0.01)。治療組與模型組比較能明顯升高SOD活性，降低MDA含量(P＜0.01)，并且治療組升高的SOD活性、降低的MDA含量已接近正常組(P﹥0.05)。

3 討論

中醫(yī)學(xué)對癡呆認(rèn)識較早，歷代醫(yī)家從不同角度多有論述?！额愖C治裁》曰:“腦為元神之府，精髓之海，實(shí)記性之所憑也……老人健忘者，腦髓漸空也?！鼻濉ぬ迫荽ā吨形麽t(yī)匯通醫(yī)經(jīng)精義》認(rèn)為:“事物之所以不忘，賴此記性，記在何處，則在腎經(jīng)，益腎生精，化為髓，而藏之于腦中?！边@說明腎中精氣是化生腦神的根本物質(zhì)基礎(chǔ)?！堆C論》曰:“血在上則濁蔽而不明矣。凡失血家猝得健忘者，每有瘀血。”《醫(yī)林繩墨》亦云:“血亂而神即失常也?！睆囊陨险撌隹梢钥闯霰静〔∥恢饕谀X，其病機(jī)為腎中精氣虧虛，氣虛則鼓動(dòng)無力，不能帥血，致血流緩慢，滯澀沉積，停留于經(jīng)脈之中而為血瘀。我們針對該病精氣虧虛、瘀阻脈絡(luò)病機(jī)特點(diǎn)，采取針刺益氣活血法治療。百會居巔頂，歸督脈，與腦聯(lián)系密切，別名“三陽五會”，具有醒腦開竅、振奮正氣、安神定志的作用;膻中為氣會穴，體內(nèi)腎中精氣、呼吸之氣、脾胃之氣都會匯聚到這個(gè)特定的地方，可調(diào)氣通絡(luò)，配合百會、氣海主治氣虛;氣海具有溫陽益氣、扶正固本、培元補(bǔ)虛之功效;膈俞為八會穴之一的血會，具有理氣寬胸、活血通脈的作用;三陰交為肝、脾、腎三條陰經(jīng)的交會穴，可調(diào)補(bǔ)肝、脾、腎三經(jīng)的氣血，三經(jīng)氣血調(diào)和，則先天之精旺盛，后天氣血充足，達(dá)到調(diào)補(bǔ)精血、益智長壽的目的。以上穴位配伍具有益氣補(bǔ)虛、活血通絡(luò)之功效，針對本病，標(biāo)本兼治。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，針刺上述穴位能明顯提高VD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為，反復(fù)性腦缺血是VD的主要病因之一，而自由基是腦缺氧后神經(jīng)細(xì)胞損害的重要發(fā)病因素［4］。中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)含大量生物膜相結(jié)構(gòu)，其中主要成分是多聚不飽和脂肪酸，易受自由基攻擊，引起脂質(zhì)過氧化，其破壞了膜結(jié)構(gòu)的完整性，膜通透性增加，使細(xì)胞內(nèi)環(huán)境紊亂。同時(shí)核酸主鏈斷裂，透明質(zhì)酸解聚，細(xì)胞崩解，線粒體變性，細(xì)胞不可逆改變，最終死亡［5］。SOD是機(jī)體內(nèi)重要的氧自由基清除酶，測定VD大鼠海馬組織中SOD含量可以間接了解海馬組織的破壞程度。MDA則是氧自由基與生物膜不飽和脂肪酸產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物，測定MDA含量可以間接反映腦組織中氧自由基的含量。海馬是與學(xué)習(xí)、記憶、情緒、行為等高級神經(jīng)活動(dòng)功能密切相關(guān)的重要部位，特別是CA1區(qū)和CA3區(qū)的突觸可塑性則與學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān)［6］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠海馬組織中SOD活性明顯下降，MDA含量明顯上升，證明造模成功;而治療組大鼠的SOD活性明顯升高，MDA含量明顯降低，說明針刺益氣活血法具有增加海馬組織中SOD活性、清除自由基的作用，促進(jìn)海馬組織神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的恢復(fù)，從而改善學(xué)習(xí)記憶等腦功能。

［1］齊剛，張莉，吳光亮，等.絞股藍(lán)總皂苷對血管性癡呆大鼠海馬一氧化氮合酶及核酸的保護(hù)作用［J］.中草藥，2003，34(7):630-632.

［2］林文注，王佩.實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)［M］.上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社，1994:147-148.

［3］王平宇.大白鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)解剖學(xué)基礎(chǔ)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1986:152-156.

［4］Corey-Bloom J，Thal LJ，Galasko D，et al.Diagnosis and evaluation of dementia［J］.Neurology，1995，45(2):211-218.

［5］周月琴，張敏.自由基清除劑與缺血性腦損傷［J］.中國藥業(yè)，2001，10(10):74-75.

［6］關(guān)建軍，姬軍風(fēng)，吳世衛(wèi)，等.針灸益氣活血方對血管性癡呆大鼠突觸可塑性的實(shí)驗(yàn)研究［J］.陜西中醫(yī)，2008，29(10):1416-1417.

Effect of acupuncture on superoxide dismutase and malondialdehyde in rat with vascular dementia rat

JI Junfeng，GUAN Jianjun，WU Shiwei.Department of Anatomy，Shanxi University of Chinese Medicine，Shanxi，Xianyang
712046

ObjectiveTo investigate the effect of acupuncture therapy with Qi-supplementing and blood-invigorating on ability of learning and memory and superoxide dismutase and malondialdehyde in hippocampal tissue of rat with vascular dementia(VD).Methods30 SD rats were randomly divided into 3 groups of 10.VD model rats were established by Pulsinelklli-4 vessel occlusion in model group and treatment group.Treatment group

Yiqihuoxue prescription which was composed of Baihui，Geshu，air sea，Sanyinjiao and Shanzhong.Morris water maze test indicators，SOD activity and MDA content in hippocampus were detected in rats of three groups.ResultsDaily escape latency of rats in model group were significantly longer than that in control group(P＜0.01)，escape latency of rat in treatment group was significantly shorter than that in the model group(P＜0.01)，but still longer than that in the control group(P＜0.01).The numbers of rat passing original platform in treatment group was more than that in model group after the first 5 days(P＜0.01).SOD activity in model group was decreased and MDA was increased in comparison with those in control group(P＜0.01，P＜0.05).SOD activity in model group was increased and MDA was decreased in comparison with those in model group(P＜0.01).And increased SOD activity and reduced MDA levels in the treatment group were closed to those of normal group(P＞ 0.05).ConclusionThe role of acupuncture therapy with Qi-supplementing and blood-invigorating on vascular dementia maybe related to improving ability of learning and memory of rat with VD，enhancing SOD activity and decreasing MDA content in hippocampal tissue of rat.

SOD;MDA;Vascular dementia;Acupuncture-moxibustion therapy

R-332;R245-33;R916.4;R977.3

A

1002-2619(2011)10-1554-03

※項(xiàng)目來源:陜西省教育廳科研資金資助項(xiàng)目(編號:06JK314)

姬軍風(fēng)(1975—)，男，主治醫(yī)師，講師，碩士。研究方向:中醫(yī)藥治療疼痛的基礎(chǔ)與臨床研究。

2011-03-25)