蘭詠梅 韓 濤 王佳蕾

(西北民族大學醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730030)

肝星狀細胞(Hepatic stellate cells，HSC)是目前研究肝纖維化(HF)發(fā)生機制中最受重視的細胞。目前認為，肝細胞壞死能激活HSC并使之增殖。HSC活化是HF最終的共同通路，是HF發(fā)生的細胞學基礎。消痰化瘀抗纖方(簡稱“抗纖方”)在臨床應用10余年，收到良好效果。本課題組在以往臨床應用基礎上，用細胞分子生物學方法探討抗纖方防治HF的作用機制，為中醫(yī)藥防治HF的臨床研究提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 肝星狀細胞株HSC-T6，購于首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院肝病研究中心，為SV40轉(zhuǎn)染SD大鼠HSC。

1.1.2 動物 SD大鼠，30只，180～220 g，SPF級，雌雄各半，由甘肅中醫(yī)學院科研實驗中心提供，實驗動物質(zhì)量合格證許可證號:SCXK(甘)2004-0006。

1.1.3 藥物 抗纖方由瓦楞子、當歸、茵陳、青皮等七味中藥組成，購自甘肅中醫(yī)學院附屬醫(yī)院中藥房。復方鱉甲軟肝片(福瑞中蒙藥科技股份有限公司，批準文號:Z19991011)。

1.1.4 主要試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)基干粉(美國，Gibco公司)，胰蛋白酶(美國，Amresco公司)，胎牛血清(杭州四季青生物制品公司)，L-谷氨酰胺、MTT、DMSO(美國，Sigma公司)。CO2培養(yǎng)箱(日本，SANYO公司)，凈化工作臺(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)，熒光倒置生物顯微鏡(麥克奧迪)，酶標儀(美國，BIO-RAD公司)，凝膠成像分析儀(上海天美科學儀器有限公司)，紫外分光光度計、TC-512型 PCR儀(英國TECHNE公司)。

1.2 方法

1.2.1 藥物血清制備

1.2.1.1 抗纖方水煎液制備 根據(jù)人與大鼠間的體表面積換算法〔1〕得到大鼠抗纖方水煎液所需高濃度(11.542 g/ml)，相當于成人(70 kg)每日1劑服用量的13.5倍。將中藥材用三級水清洗2遍，加入三級水1 400 ml，浸泡30 min，加熱沸騰后煎煮30 min，煎煮2次;第二煎加水700 ml，兩次煎液過濾合并共900 ml〔2〕濃縮至11.542 g/ml。將此液體分別用一級水稀釋到相當于成人每日1劑服用量的1.5、4.5倍，分別含生藥1.282、3.848 g/ml。

1.2.1.2 復方鱉甲軟肝片水溶液制備 將藥物研磨為極細粉末，與成人正常服用劑量相當，一級水溶解，制成混懸液，濃度54 mg/ml。

1.2.1.3 含藥血清制備〔3〕取SD大鼠30只，采用隨機數(shù)字法分為5組，每組6只，雌雄各半。分別為正常血清組、復方鱉甲軟肝片組(軟肝片組)、抗纖方高劑量(13.5倍)組、中劑量(4.5倍)組、低劑量(1.5倍)組。除正常血清組灌胃等量0.9%NaCl注射液，其余各組灌胃相應濃度的藥物，分2次灌服，連續(xù)6 d。第6天晚，開始禁食，不禁水，第7天按常規(guī)量灌胃1次，2 h后，腹腔注射麻醉，股動脈采血，室溫靜置4 h，3 000 r/min，15 min，離心分離血清。將同一組動物相同條件下所采血清混合，56℃水浴中滅活30 min，0.22μm微孔濾膜過濾，密封后－20℃冷藏保存?zhèn)溆?。臨用前加入DMEM培養(yǎng)液，配成含10%藥物血清的培養(yǎng)液。

1.2.2 細胞基本實驗

1.2.2.1 細胞培養(yǎng)和傳代 采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在37℃，5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)。5～7 d后，當細胞相互接近呈單層致密狀時，倒掉培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS清洗細胞，去除殘留含血清培養(yǎng)液〔4〕。加入0.125%胰蛋白酶2 ml消化，靜置5 min，在顯微鏡下觀察。當細胞的形狀模糊趨向于球形，倒掉胰蛋白酶，加入含血清的DMEM培養(yǎng)液10 ml終止消化，吹打瓶壁上的細胞成懸液，1 000 r/min，5 min，離心，去除上清液，收集細胞沉淀，加入新的含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，用吸管吹打使之重新形成細胞懸液，接種傳代。

1.2.2.2 細胞凍存和復蘇 用胰蛋白酶把單層生長的對數(shù)生長期細胞消化下來，依據(jù)傳代的方法把消化好的細胞收集于離心管離心。收集細胞沉淀，加入配制好的細胞凍存液，吹打均勻，分裝入無菌凍存管中，每管1 ml。將用封口膜封好的凍存管液氮凍存。復蘇時將凍存管迅速從液氮中取出，直接投入37℃水浴中，輕輕搖動使其盡快融化。開啟凍存管，加入培養(yǎng)液與細胞懸液混合，低速離心，去除含DMSO的上清液，用生長培養(yǎng)液稀釋，接種于培養(yǎng)瓶，放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2.3 細胞計數(shù) 首先用吸管吹打形成單細胞懸液，在血細胞計數(shù)板上蓋玻片一側(cè)加微量的細胞懸液，在顯微鏡下觀察計數(shù)板四角大方格中的細胞數(shù)。細胞壓中線時，只計左側(cè)和上方者，不計右側(cè)和下方者。根據(jù)公式計算得出細胞密度:細胞密度(個/ml原液)=(4個大格細胞數(shù)之和/4)×104。

1.2.3 細胞增殖實驗 以MTT比色法〔5，6〕檢測HSC的增殖。傳代培養(yǎng)的HSC，取處于對數(shù)生長期細胞，消化為單細胞懸液，通過細胞計數(shù)，向細胞中加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為1×105個/ml。細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100μl，培養(yǎng)24 h后棄上清，換為10%含藥血清培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞，進行以下分組實驗，每組設6個復孔。1組:正常血清組;2組:軟肝片組;3組:抗纖方高劑量組;4組:抗纖方中劑量組;5組:抗纖方低劑量組。分別在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72 h后，在顯微鏡下觀察細胞生長情況，每孔加入MTT溶液10μl，置37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心棄去孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入100μl DMSO，10 min振蕩混勻，使結(jié)晶充分溶解。選擇490 nm波長，以空白對照孔調(diào)零，在酶標儀上測定各孔光吸收度(A)值。抑制率=(對照孔A490－實驗孔A490)/對照孔A490×100%。

1.3 統(tǒng)計學分析 統(tǒng)計數(shù)據(jù)均用x±s表示，采用 SPSS16.0軟件處理，多組間單因素比較采用方差分析，應用最小顯著差法(LSD)進行兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1 各組藥物血清作用于HSC不同時間對HSC增殖抑制率的影響比較 結(jié)果顯示，藥物血清干預24 h后，軟肝片組與正常血清組相比更能抑制HSC體外生長(P＜0.05)，增殖抑制率為3.32%。抗纖方藥物血清高、中、低劑量組干預HSC 24 h后與正常血清組相比，對其體外生長抑制作用均有顯著性差異(P＜0.05)，增殖抑制率依次為15.65%，11.91%，7.62%。

藥物血清干預48 h后與正常組相比，軟肝片組、抗纖方高劑量組、中劑量組、低劑量組對HSC的體外生長抑制作用均有非常顯著的差異(P＜0.05)，增殖抑制率依次為7.06%、18.27% ，13.64% ，9.01% 。

藥物血清干預72 h后與正常血清組相比，軟肝片組、抗纖方高劑量組、中劑量組、低劑量組對HSC的體外生長抑制作用均有非常顯著的差異(P＜0.05)，增殖抑制率依次為10.20%、21.73%，15.19%，11.42%?？估w方低劑量組與軟肝片組比較，對HSC體外生長的抑制無顯著性差異(P＞0.05)?？梢?，與正常血清組相比抗纖方藥物血清對HSC的增殖有一定的量-效關系。見圖1。

圖1 HSC培養(yǎng)及加入藥物血清后的HSC(×400)

2.2 各組藥物血清對HSC作用不同時間490 nm波長OD值比較 正常大鼠血清干預HSC后，隨著時間的延長，細胞的增殖呈增長趨勢，HSC細胞活力旺盛，促進HSC的生長。見表1。

表1 各組藥物血清對HSC作用不同時間的OD值(x±s)

3 討論

HF的形成和發(fā)生是一個多因素相互促進、相互制約的結(jié)果。目前認為HSC在HF發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要作用，也是目前研究HF發(fā)生機制中最受重視的細胞。肝細胞壞死能激活HSC并使之增殖〔7〕，HSC活化是HF最終的共同通路，是HF發(fā)生的細胞學基礎。對于HF的治療，目前尚無理想藥物。已報道的秋水仙堿、青霉胺等十幾種藥物雖可抑制HF，但毒副作用較大，故臨床上應用受到限制。近年來廣泛開展了中藥抗纖維化實驗與臨床研究，為臨床治療提供了許多經(jīng)驗。中醫(yī)傳統(tǒng)上的治則是活血化瘀、軟堅消癥。本院韓濤副教授從“痰瘀互結(jié)”機制自擬“消痰化瘀抗纖方”，由瓦楞子、茵陳、當歸、青皮等中藥組成，其特點在于不僅活血化瘀，更為重要的是治痰。該方臨床應用已有十余年，療效較好，有效率為91%。本實驗采用MTT比色法檢測抗纖方藥物血清對HSC生長增殖的影響，旨在從細胞分子生物學水平探討抗纖方防治HF的作用機制，為中醫(yī)藥防治HF的臨床研究提供實驗依據(jù)。

結(jié)果表明，抗纖方藥物血清可以顯著抑制HSC增殖，與正常血清組比較有顯著性差異，并呈現(xiàn)時效和量效關系;當抗纖方高劑量作用HSC 72 h時，抑制作用最為明顯(增殖抑制率為21.73%)，與文獻中的趨勢相當〔8～10〕。加入正常大鼠血清培養(yǎng)的HSC，隨著時間的延長OD值逐漸增加，且72 h組顯著高于24 h組，提示在大鼠血清中含有可直接或間接促進HSC增殖的物質(zhì)。單純從OD值分析，抗纖方藥物血清干預HSC后，隨時間延長細胞增殖趨勢上升，但是由于增殖抑制率是通過與對照組對比得出相對比值，正常血清組的OD值上升趨勢更大，所以增殖抑制率總體上是上升的。因此，抗纖方藥物血清可顯著抑制HSC的體外增殖，當高劑量組作用72 h時，抑制作用最強，而且無明顯的細胞毒性作用。

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