吉海杰，周 蕾，陳乃宏

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院·北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，北京 100050;2.山西省中醫(yī)藥研究院，山西 太原 030012;3.中國(guó)藥科大學(xué)，江蘇南京 210009)

卒中(stroke)是一種突發(fā)性的以腦血液循環(huán)障礙為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，嚴(yán)重危害到人類的健康。由于缺血大腦組織氧/能量代謝不足，最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡引起行為功能的喪失或認(rèn)知缺陷。1970年P(guān)aniker等［1］提出氧化應(yīng)激的概念，指生物體內(nèi)自由基的產(chǎn)生與清除失衡，導(dǎo)致其蓄積而引起的氧化損傷過程。生物體內(nèi)自由基包括氧自由基如超氧陰離子、羥自由基、單線態(tài)氧、過氧化氫和氮自由基如一氧化氮(NO)和亞硝基陰離子。正常情況下，自由基產(chǎn)生和清除保持平衡，但在缺血等病理?xiàng)l件下過量NO與超氧陰離子生成亞硝基陰離子，攻擊DNA、RNA和蛋白質(zhì)，引起基因突變、酶活性喪失以及細(xì)胞代謝紊亂，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡和解體［2］，產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷。

依達(dá)拉奉(edaravone，EDA，化學(xué)結(jié)構(gòu)見Fig 1)是由日本開發(fā)并于2001年在日本上市，實(shí)驗(yàn)室和和臨床研究表明EDA在急性腦梗死的治療中具有良好的神經(jīng)保護(hù)作用［3-5］。依達(dá)拉奉作為一種新型自由基清除劑對(duì)氧自由基［6-7］和氮自由基［8］均具有清除作用，本研究以硝普鈉(sodium nitroprusside，SNP)在水溶液中產(chǎn)生NO從而誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，觀察依達(dá)拉奉對(duì)PC12細(xì)胞的保護(hù)作用并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行初步研究。

Fig 1 Chemical structure of edaravone

1 材料與方法

1.1藥物與試劑依達(dá)拉奉，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，二甲基亞砜(DMSO)溶解配制成0.1 mol·L-1的儲(chǔ)備液，實(shí)驗(yàn)時(shí)用培養(yǎng)基稀釋至相應(yīng)濃度。硝普鈉、MTT購(gòu)于Sigma公司;Annexin V-FITC/PI試劑盒，購(gòu)于碧云天生物技術(shù)有限公司;DMEM培養(yǎng)基、馬血清及胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;β-actin、Bax、Bcl-2 多克隆抗體為 Santa Cruz公司產(chǎn)品;其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2細(xì)胞株P(guān)C12細(xì)胞由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)所細(xì)胞中心提供，培養(yǎng)于含5%胎牛血清和5%馬血清的DMEM培養(yǎng)基中，常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器倒置顯微鏡(Nikon，日本)，流式細(xì)胞儀(BD，美國(guó))，凝膠成像儀(Fuji，日本)。

1.4細(xì)胞模型建立及藥物處理待PC12細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)至鋪滿單層后，輕輕吹打形成單細(xì)胞懸液，倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)，用培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為108·L-1。將細(xì)胞接種在96孔板中，每孔100 μl。24 h后加入含不同濃度硝普鈉培養(yǎng)基，終濃度在300～800 μmol·L-1之間，共設(shè)6個(gè)濃度組。對(duì)照組加入DMEM完全培養(yǎng)液。37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后MTT法測(cè)定細(xì)胞活力。

選擇細(xì)胞活力降低為正常值的50%～60%的硝普鈉濃度為后續(xù)造模條件。將細(xì)胞接種24 h后，造模同時(shí)加入25～125 μmol·L-1濃度的依達(dá)拉奉，共設(shè)5個(gè)濃度組。對(duì)照組加入DMEM完全培養(yǎng)液。

1.5MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率藥物處理24 h后，每孔加入5 g·L-1MTT 溶液10 μl，37℃孵育4 h 充分反應(yīng)生成甲臜，然后每孔加入三聯(lián)液100 μl，37℃孵育過夜充分溶解甲臜。測(cè)定570 nm吸光度(A)，根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞存活率(%):

1.6流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡細(xì)胞處理同前。去除細(xì)胞培養(yǎng)液，胰酶消化、收集細(xì)胞，PBS洗細(xì)胞3次，用PBS重懸細(xì)胞并調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為109·L-1，按Annexin V-FITC/PI試劑盒說(shuō)明書操作，然后在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)。每組3個(gè)樣本，計(jì)數(shù)10 000個(gè)細(xì)胞，檢測(cè)結(jié)果使用Win MDI 2.8軟件分析。

1.7Western blot測(cè)定Bax與Bcl-2蛋白變化細(xì)胞處理同前。刮取細(xì)胞于3 000 r·min-1離心5 min，去上清，加入 100 μl細(xì)胞裂解液(50 mmol·L-1Tris-HCl，150 mmol·L-1NaCl，1%NP-40，1 mmol·L-1PMSF，50 mg·L-1Leupeptin，1 mg·L-1pepstatin A，20 mg·L-1aprotinin，1 mmol·L-1EDTA，1 mmol·L-1NaVO3，50 mmol·L-1NaF，20 mmol·L-1pH 8.0)，提取總蛋白，BCA法測(cè)定樣品總蛋白含量。每組取總蛋白20 μg上樣，于15%SDS-PAGE電泳分離，電泳完畢轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，3%BSA室溫封閉2 h，加入Bax(1∶1 000)或Bcl-2(1∶500)或 β-actin(1∶1 000)于4℃孵育過夜，TBST洗5 min，3次，加HRP標(biāo)記羊抗兔或抗小鼠IgG(1∶5 000)室溫孵育2 h，TBST洗5 min，3次，ECL顯色，LAS-3000型化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)采集圖像。

1.8數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)以±s表示，用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1依達(dá)拉奉對(duì)硝普鈉誘導(dǎo)PC12細(xì)胞存活率的影響本實(shí)驗(yàn)采用梯度濃度硝普鈉與PC12細(xì)胞共孵育24 h，F(xiàn)ig 2A所示細(xì)胞活力隨著硝普鈉濃度的遞增而降低，本實(shí)驗(yàn)選定硝普鈉500 μmol·L-1為造模條件進(jìn)行后續(xù)研究。

細(xì)胞接種24 h后除空白組外其余均加入500 μmol·L-1硝普鈉，同時(shí)除模型組外其余加入不同濃度(25～125 μmol·L-1)依達(dá)拉奉，如 Fig 2B 所示依達(dá)拉奉能濃度依賴性增加PC12細(xì)胞的存活率，在濃度 75 μmol·L-1時(shí)達(dá)到峰值。

Fig 2 (A)Concentration-effect curve of sodium nitroprusside(SNP)on PC12 cells for 24 h(n=6).＊＊P＜0.01 vs normal(SNP=0).(B)Effects of edaravone(EDA)on PC12 cells viability injured by SNP(500 μmol·L －1)exposured for 24 h(n=6). ＊＊P＜0.01 vs model(EDA=0).

2.2細(xì)胞形態(tài)學(xué)的觀察如Fig 3所示，倒置顯微鏡下觀察正常PC12細(xì)胞貼壁、飽滿并呈多角形;而硝普鈉損傷后細(xì)胞變圓，細(xì)胞碎片增多。依達(dá)拉奉25 μmol·L-1和 75 μmol·L-1能明顯增加存活細(xì)胞數(shù)目，形態(tài)學(xué)表明依達(dá)拉奉對(duì)硝普鈉誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。

2.3依達(dá)拉奉對(duì)氧化應(yīng)激PC12細(xì)胞凋亡的影響

流式直方圖中左下方表示正?；罴?xì)胞(Annexin V-和PI-)，右下方表示早期凋亡細(xì)胞(Annexin V+和PI-)，右上方表示壞死和凋亡晚期細(xì)胞(Annexin V+和PI+)。如Fig 4所示，硝普鈉處理PC12細(xì)胞24 h后早期凋亡是細(xì)胞損傷的主要形式，由空白組的4.7%升高到模型組的57.2%，依達(dá)拉奉25 μmol·L-1和75 μmol·L-1給藥組分別減少至42.4%和26.4%，表明依達(dá)拉奉對(duì)硝普鈉誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡有保護(hù)作用。

Fig 3 Morphological analysis of PC12 cells by phase-contrast microscopy.

Fig 4 Protective effects of edaravone on PC12 cells apoptosis induced by sodium nitroprusside(500 μmol·L －1，24 h).

2.4依達(dá)拉奉對(duì)Bax與Bcl-2表達(dá)變化的影響如Fig 5所示，細(xì)胞經(jīng)500 μmol·L-1硝普鈉處理后與空白對(duì)照組比較，胞質(zhì)Bax表達(dá)明顯升高，Bcl-2表達(dá)明顯減少，從而使Bax/Bcl-2比值升高，表明細(xì)胞凋亡水平上升。與模型組相比，依達(dá)拉奉25 μmol·L-1給藥組Bax表達(dá)無(wú)明顯變化，Bcl-2表達(dá)略有升高，而75 μmol·L-1給藥組Bax表達(dá)明顯下降，Bcl-2表達(dá)明顯升高，表明細(xì)胞凋亡水平下降。

Fig 5 Effects of edaravone(EDA)on Bax and Bcl-2 expression in PC12 cells exposured to sodium nitroprusside(SNP，500 μmol·L －1)for 24 h.

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激在神經(jīng)損傷機(jī)制研究中占有重要地位［9］。生理水平的NO是胞內(nèi)信使分子，其產(chǎn)生和消除處于平衡狀態(tài)，而在腦缺血情況下，NO在腦部堆積對(duì)神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生毒性損傷［10-11］。研究表明依達(dá)拉奉通過清除羥自由基及過氧亞硝酸鹽等自由基達(dá)到抑制脂質(zhì)過氧化的作用［12］，同時(shí)依達(dá)拉奉能降低誘導(dǎo)型NOS的表達(dá)從而減少氧化應(yīng)激反應(yīng)［13］。硝普鈉作為NO供體廣泛用于模擬腦缺血NO對(duì)神經(jīng)細(xì)胞損傷的體外研究，本實(shí)驗(yàn)以硝普鈉誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，觀察依達(dá)拉奉的神經(jīng)保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)利用MTT法測(cè)定線粒體酶的活力間接反映細(xì)胞活力。結(jié)果表明濃度超過400 μmol·L-1的硝普鈉與PC12細(xì)胞孵育24 h能明顯抑制MTT代謝率，說(shuō)明硝普鈉釋放NO對(duì)細(xì)胞線粒體功能造成障礙;依達(dá)拉奉能濃度依賴性改善MTT代謝率，在75 μmol·L-1達(dá)到峰值，表明依達(dá)拉奉對(duì)硝普鈉釋放NO造成的線粒體損傷具有保護(hù)作用。形態(tài)學(xué)觀察表明500 μmol·L-1硝普鈉與PC12細(xì)胞孵育24h細(xì)胞變圓、碎片增多，表明細(xì)胞發(fā)生損傷;依達(dá)拉奉 25 μmol·L-1和 75 μmol·L-1組細(xì)胞碎片明顯減少，表明依達(dá)拉奉能增加存活細(xì)胞數(shù)目。在細(xì)胞凋亡研究中，Annexin V/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡是較為常用、公認(rèn)的凋亡檢測(cè)方法，可區(qū)分早期凋亡和晚期凋亡。硝普鈉處理PC12細(xì)胞24 h后早期凋亡是細(xì)胞損傷的主要形式，依達(dá)拉奉75 μmol·L-1組能減少早期凋亡細(xì)胞數(shù)目。

細(xì)胞的凋亡與抗凋亡之間存在一種精細(xì)的平衡，一旦這種平衡被打破，則可啟動(dòng)細(xì)胞的凋亡程序，任何外界因素只要能激活凋亡啟動(dòng)分子或降低凋亡啟動(dòng)閾值均可促使細(xì)胞凋亡的發(fā)生［14］。自由基可通過線粒體依賴途徑導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Bcl-2為抗凋亡蛋白，定位于線粒體上，其功能是維持線粒體膜的完整性，控制著線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔，其與凋亡蛋白Bax形成Bcl-2/Bax異二聚體使細(xì)胞免于凋亡，而Bax/Bax同二聚體則使細(xì)胞易于凋亡，因此Bcl-2/Bax的比值決定細(xì)胞對(duì)誘導(dǎo)凋亡信號(hào)的敏感性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，硝普鈉誘導(dǎo)PC12細(xì)胞Bcl-2表達(dá)下降，Bax表達(dá)上升，從而降低Bcl-2/Bax的比值;依達(dá)拉奉75 μmol·L-1給藥組與模型組比較Bcl-2表達(dá)上調(diào)，Bax表達(dá)下調(diào)，從而升高Bcl-2/Bax的比值，表明依達(dá)拉奉能抑制硝普鈉引起的細(xì)胞凋亡。

本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞水平研究依達(dá)拉奉對(duì)硝普鈉誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用，結(jié)果表明依達(dá)拉奉能明顯增加硝普鈉處理PC12細(xì)胞活力，改善細(xì)胞形態(tài)，減少凋亡細(xì)胞比例，這可能與依達(dá)拉奉清除硝普鈉釋放NO，從而減少氧化應(yīng)激有關(guān)。

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