李 媛，劉善文，李華榮，馬文波，潘廷才，朱林燕，葉文才，王立偉，陳麗新

(暨南大學(xué)1.醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系、2.醫(yī)學(xué)院生理學(xué)系、3.藥學(xué)院，廣東廣州 510632)

丹參是臨床常用中藥，廣泛應(yīng)用于治療心血管疾病，具有擴(kuò)張血管、降壓、抗血栓的功能，對(duì)治療冠心病、心絞痛、心律過速有明顯療效［1］。丹參酮ⅡA(TanⅡA)是丹參的主要提取物之一。近年來，人們發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有抑制增殖，促進(jìn)凋亡，誘導(dǎo)分化的作用［2］。我們前期的研究表明［3-4］，氯通道在細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期中發(fā)揮重要作用，與順鉑誘導(dǎo)的低分化鼻咽癌細(xì)胞凋亡相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)擬采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)直接觀察丹參酮ⅡA對(duì)低分化鼻咽癌細(xì)胞氯離子通道的激活作用，并分析丹參酮ⅡA誘導(dǎo)的電流特征，為進(jìn)一步闡明丹參酮ⅡA誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)低分化鼻咽癌細(xì)胞CNE-2Z用含10% 新生牛血清(Gibco，美國)、1 × 105U·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的 RPMI 1640培養(yǎng)液(Gibco，美國)在 37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中，按常規(guī)方法傳代。實(shí)驗(yàn)前消化細(xì)胞，將細(xì)胞懸液接種在直徑22 mm的圓形玻片上，放入培養(yǎng)箱，待細(xì)胞貼壁1 h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2主要試劑及來源丹參酮ⅡA購自深圳美荷生物科技有限公司，用二甲基亞砜(DMSO)配制成10 mmol·L-1儲(chǔ)存液，使用前用細(xì)胞灌流液稀釋至1 nmol·L-1;氯通道阻斷劑 5-nitro-2-(3-henylpropylamino)benzoic acid(NPPB)，用 DMSO配制成100 mmol·L-1儲(chǔ)存液，使用前稀釋至 100 μmol·L-1。除特殊說明外，所有的試劑和藥品均購于美國Sigma公司。

1.3細(xì)胞外灌流液等張灌流液滲透壓為300 mOsm·L-1，含(mmol·L-1):70 NaCl、0.5 MgCl2、2 CaCl2、10 HEPES和140 D-甘露醇。高張灌流液滲透壓為440 mOsm·L-1，除增加140 mmol·L-1D-甘露醇外，其它成份和濃度與等張灌流液相同。灌流液用Tris-base液調(diào)pH值至7.40，用冰點(diǎn)滲透壓計(jì)(Osmomat030;Gonotec，Germany)檢測(cè)滲透壓。

1.4電極內(nèi)液電極內(nèi)液含(mmol·L-1):70N-methyl-D-glucamine chloride(NMDG-Cl)、1.2 MgCl2、10 HEPES、1 EGTA、140 D-甘露醇和 2 ATP，用 Trisbase調(diào)pH值至7.25，用孔徑0.22 μm的無菌過濾器過濾。滲透壓為300 mOsm·L-1。

1.5全細(xì)胞膜片鉗記錄用EPC-7膜片鉗放大器(List Electronic，Germany)記錄單個(gè)細(xì)胞的全細(xì)胞電流。電流和電壓信號(hào)用 CED1401(Cambrige，UK)數(shù)字化(采樣頻率 3 kHz)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用 EPC(CED，Cambridge，UK)軟件分析。在電壓鉗制模式下，細(xì)胞被鉗制在0、±40、±80 mV，每個(gè)鉗制脈沖波間隔4 s，持續(xù)200 ms，不斷反復(fù)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)在室溫(20℃ ～24℃)下進(jìn)行。

貼有細(xì)胞的玻片安放在灌流槽中，全細(xì)胞記錄形成后，記錄穩(wěn)定的背景電流，隨后用丹參酮ⅡA激活氯電流，記錄激活電流的潛伏期、達(dá)峰時(shí)間、電流密度等。電流達(dá)到峰值并平穩(wěn)后，加入 NPPB，待電流達(dá)到最小值并平穩(wěn)后終止記錄。計(jì)算NPPB對(duì)丹參酮ⅡA激活電流的抑制率。抑制率的計(jì)算公式為:抑制率/% =〔(CTan-CIso)-(CBlockers-CIso)〕/(CTan-CIso)×100%，其中CIso是等張條件下的電流值，CTan是丹參酮ⅡA激活的電流最大值，CBlockers是加入阻斷劑后的最大效應(yīng)時(shí)的電流值。

在觀察丹參酮ⅡA激活氯通道的容積敏感性實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)?shù)⑼駻激活細(xì)胞電流達(dá)到峰值并穩(wěn)定后，換為含相同濃度丹參酮 ⅡA的高滲灌流液，觀察滲透性細(xì)胞容積縮小對(duì)丹參酮ⅡA激活氯電流的影響。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用方差分析(Anova)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)用±s表示，每次實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次以上。

2 結(jié)果

2.1丹參酮ⅡA激活CNE-2Z細(xì)胞氯通道如Fig 1A所示，細(xì)胞背景電流較小而且穩(wěn)定。在-80 mV電壓鉗制下，氯離子從細(xì)胞內(nèi)流向細(xì)胞外，形成內(nèi)向電流，平均電流密度為(-5.6±0.9)pA/pF;在+80 mV電壓鉗制下，氯離子從細(xì)胞外流向細(xì)胞內(nèi)，形成外向電流，平均電流密度為(4.8±0.6)pA/pF。隨后用含有1 nmol·L-1丹參酮ⅡA的等張灌流液連續(xù)灌流時(shí)，可激活一個(gè)電流，激活潛伏期為(67.9±18.2)s，隨藥物作用時(shí)間延長，電流逐漸增大，約(1051.5±215.3)s達(dá)到峰值進(jìn)入平穩(wěn)期。如Fig 1B所示，在±120 mV電壓持續(xù) 300 ms鉗制條件下，該電流沒有明顯電壓依從性失活和時(shí)間依從性失活。Fig 1C顯示了丹參酮ⅡA激活電流的全程圖。在 -80 mV電壓鉗制下，內(nèi)向電流峰值的電流密度為(-54.2±13.7)pA/pF，+80 mV電壓鉗制下外向電流的電流密度為(71.0±16.1)pA/pF，外向電流較之內(nèi)向電流大，表現(xiàn)了較明顯外向優(yōu)勢(shì)(n=8，P=0.010)，該電流的翻轉(zhuǎn)電位為(-5.9±0.2)mV(n=8)，見 Fig 1D。

Fig 1 TanshinoneⅡA-induced whole-cell currents in CNE-2Z cells

2.2高張液對(duì)丹參酮ⅡA激活氯電流的抑制作用在細(xì)胞外灌流含1 nmol·L-1丹參酮ⅡA的等張灌流液，激活電流并達(dá)到峰值穩(wěn)定3min后，換用含相同濃度的丹參酮ⅡA的高張液(Hyper)灌流，如Fig 2所示，440 mOsm·L-1高張灌流液可以迅速完全抑制丹參酮ⅡA激活的氯電流。Fig 2A和2B分別顯示了丹參酮ⅡA激活的氯電流和高張液的抑制作用的瞬時(shí)圖，F(xiàn)ig 2C顯示了高張液抑制作用的全過程。在-80 mV電壓鉗制下，高張液使丹參酮ⅡA激活的內(nèi)向電流從(-54.2±13.7)pA/pF下降到(-7.1±2.3)pA/pF，抑制率為(97.0±3.2)%(n=5，P=0.005)，+80 mV 電壓鉗制下，外向電流從(71.0±16.1)pA/pF下降到(7.2±3.5)pA/pF，抑制率為(96.5±4.2)%(P=0.004)。高張液對(duì)內(nèi)外向電流的抑制率差異沒有顯著性(P=0.618)，見Fig 2D。丹參酮ⅡA激活的氯電流被高張液抑制，表明該電流具有容積敏感性。

2.3氯通道阻斷劑對(duì)丹參酮ⅡA激活氯電流的抑制作用NPPB是常用的氯通道阻斷劑，本實(shí)驗(yàn)觀察了NPPB對(duì)丹參酮ⅡA激活氯電流的影響。Fig 3A和3B分別 顯示了100 μmol·L-1NPPB抑制丹參酮ⅡA激活的電流的瞬時(shí)圖和全過程。電壓鉗制在 ±80 mV時(shí)，等張灌流液組(Iso)、丹參酮ⅡA組(TanⅡA)、丹參酮ⅡA+氯通道阻斷劑組(TanⅡA+NPPB)組的電流密度見Fig 3C。結(jié)果表明，NPPB可抑制丹參酮ⅡA激活的氯電流，-80 mV電壓鉗制下，內(nèi)向電流從(-54.2±13.7)pA/pF下降到(-14.1±4.3)pA/pF，抑制率為(75.8±11.3)%(n=5，P=0.031)，+80 mV電壓鉗制下，外向電流從(71.0±16.1)pA/pF下降到(21.1±7.9)pA/pF，抑制率為(76.8±10.3)%(P=0.017)，NPPB對(duì)內(nèi)外向電流的抑制率差異沒有顯著性(P=0.668)。

Fig 2 Inhibition of tanshinoneⅡA-induced chloride currents by hypertonic solutions

Fig 3 Inhibition of tanshinoneⅡA-induced chloride currents by chloride channel blocker NPPB

3 討論

近年研究發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA可通過降低VEGF［5］、突變型 p53 蛋白和 Bcl-2 蛋白的表達(dá)［6］，上調(diào) Fas、Caspase-3 mRNA［7］，抑制原癌基因 cmyc［8］和 BCRP/ABCG2 基因［9］的表達(dá)等發(fā)揮抗癌作用。

研究表明，氯通道與細(xì)胞容積調(diào)節(jié)［10-11］、細(xì)胞增殖和周期［3］、細(xì)胞遷移［12］及細(xì)胞凋亡［3，13-14］密切相關(guān)。我們前期的研究表明，氯通道參與凋亡性細(xì)胞容積減小，凋亡誘導(dǎo)劑順鉑和過氧化氫在短時(shí)間內(nèi)激活氯通道，引起細(xì)胞內(nèi)氯離子和鉀離子的外流，同時(shí)伴隨水的外流而導(dǎo)致細(xì)胞容積減小，誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞凋亡，NPPB抑制順鉑和過氧化氫誘導(dǎo)的凋亡，提示氯通道參與了凋亡的發(fā)生［4，13］。丹參酮ⅡA誘導(dǎo)凋亡的作用是否與氯通道相關(guān)，鮮見文獻(xiàn)報(bào)道。

本研究用膜片鉗方法，直接觀察丹參酮ⅡA對(duì)氯離子通道的激活作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，細(xì)胞外灌流低濃度丹參酮ⅡA可激活一個(gè)具有明顯外向優(yōu)勢(shì)的電流，該電流在不同鉗制電壓下其電流方向和 Cl-運(yùn)動(dòng)方向一致，電流的翻轉(zhuǎn)電位接近于 Cl-的平衡電位(-0.9 mV)，推測(cè)該電流為氯電流。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)，氯通道阻斷劑NPPB可抑制該電流，因此這是一個(gè)由氯通道介導(dǎo)的氯電流，本結(jié)果為丹參酮ⅡA激活氯通道提供了直接的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，提示丹參酮ⅡA可能通過某些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，激活細(xì)胞膜氯離子通道，誘發(fā)細(xì)胞凋亡性容積減小，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而發(fā)揮其抗癌作用。

丹參酮ⅡA激活的氯電流具有明顯的外向優(yōu)勢(shì)，無明顯的時(shí)間依從性失活和電壓依從性失活，可以被高張灌流液完全抑制，被NPPB抑制，且對(duì)內(nèi)外向電流抑制作用差異無顯著性，這些特征與我們以前報(bào)道的鼻咽癌細(xì)胞容積敏感性氯通道［3］的特征相似，但容積敏感性氯通道是在細(xì)胞外低張環(huán)境或細(xì)胞內(nèi)高張環(huán)境引起細(xì)胞腫脹時(shí)而激活，而本實(shí)驗(yàn)中，氯通道是在等張環(huán)境、非細(xì)胞腫脹條件下而被丹參酮ⅡA激活，即激活氯通道的條件不同，提示這兩種通道的激活途徑不一樣。綜上所述，丹參酮ⅡA可以激活低分化鼻咽癌細(xì)胞氯通道，但其具體的激活途徑，以及激活氯通道后對(duì)細(xì)胞功能的影響等有待探討。

［1］高 艷.丹參的藥理作用［J］.中國實(shí)用醫(yī)藥，2009，4(14):168-9.

［1］Gao Y.Pharmacological action of Salvia Miltiorrhiza［J］.China Pract Med，2009，4(14):168-9.

［2］孫兆卿，王壽福.丹參酮ⅡA抗腫瘤作用研究進(jìn)展［J］.云南中醫(yī)中藥雜志，2010，31(7):70-2.

［2］Sun Z Q，Wang S F.Research advance in anti-tumor function of tanshioneⅡA［J］.Yunnan J Tradit Chin Med Mat Med，2010，31(7):70-2.

［3］Chen L X，Zhu L Y，Tacob T J，et al.Roles of volume-activated Cl-currents and regulatory volume decrease in the cell cycle and proliferation in nasopharyngeal carcinoma cells［J］.Cell Proliferation，2007，40(2):253-67.

［4］范愛輝，王立偉，毛建文，等.氯通道在順鉑誘導(dǎo)的鼻咽癌細(xì)胞凋亡性容積減小中的作用［J］.山東醫(yī)藥，2007，47(19):40-2.

［4］Fan A H，Wang L W，Mao J W，et al.Role of chloride channels in apoptotic volume decrease of nasopharyngeal carcinoma cells induced by cDDP［J］.Shandong Med J，2007，47(19):40-2.

［5］文道林，田 峰，吳少卿.丹參酮ⅡA對(duì)缺氧誘導(dǎo)下鼻咽癌CNE-2細(xì)胞增殖、VEGF表達(dá)及NO分泌水平的影響［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)藥雜志，2010，7(12):749-52.

［5］Wen D L，Tian F，Wu S Q.Influence of tanshioneⅡAon proliferation and expression of VEGF and secretion of NO of CNE-2 cells under hypoxia［J］.Mod Med J Chin，2010，7(12):749-52.

［6］張 欣，張蒲蓉，陳 潔，等.丹參酮ⅡA對(duì)乳腺癌抑制作用的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究［J］.四川大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2010，41(1):62-7.

［6］Zhang X，Zhang P R，Chen J，et al.A study on the effect of tanshinoneⅡA against human breast cancerin vivo［J］.J Sichuan Univ(Med Sci Ed)，2010，41(1):62-7.

［7］王 炎，李 琦，范忠澤，等.丹參酮ⅡA介導(dǎo)p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞凋亡［J］.世界華人消化雜志，2009，17(2):124-9.

［7］Wang Y，Li Q，F(xiàn)an Z Z，et al.TanshinoneⅡA induces apoptosis of liver cancer cells via p38MAPK signal transduction［J］.World Chin J Digestol，2009 ，17(2):124-9.

［8］鄧 惠，羅煥敏，黃 豐，等.丹參酮ⅡA對(duì)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡作用［J］.中國病理生理雜志，2005，21(9):1791-4.

［8］Deng H，Luo H M，Huang F，et al.Inhibition of proliferation and induction of apoptosis by tanshinoneⅡA in C6 cells［J］.Chin J Pathophysiol，2005，21(91):1791-4.

［9］敬 靜，鄭 鴻，王 靜，等.丹參酮ⅡA對(duì)人ER陰性乳腺癌細(xì)胞的生長抑制和多耐藥逆轉(zhuǎn)作用［J］.四川大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2007，38(3):391-5.

［9］Jing J，Zheng H，Wang J，et al.Growth inhibition and multidrug resistance-reversing effect of tanshinoneⅡA on human breast cancer cell with estrogen receptor negative［J］.J Sichuan Univ(Med Sci Ed)，2007，38(3):391-5.

［10］Okada Y，Maeno E，Shimizu T，et al.Receptor-mediated control of regulatory volume decrease(RVD)and apoptotic volume decrease(AVD)［J］.J Physiol，2001，532(1):3-16.

［11］陳麗新，王立偉，朱林燕，等.Cl-在鼻咽癌細(xì)胞調(diào)節(jié)性容積回縮中的作用［J］.中國病理生理雜志，2002，18(5):490-3.

［11］Chen L X，Wang L W，Zhu L Y，et al.Role of Cl-in regulatory volume decrease of nasopharyngeal carcinoma cells［J］.Chin J Pathophysiol，2002，18(5):490-3.

［12］Mao J M，Wang L W，F(xiàn)an A H，et al.Blockage of volume-activated chloride channels inhibits migration of nasopharyngeal carcinoma cells［J］.Cell Physiol Biochem，2007，19(5-6):249-58.

［13］Zuo W H，Zhu L Y，Bai Z Q，et al.Chloride channels involve in hydrogen peroxide-induced apoptosis of PC12 cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，2009，387(4):666-70.

［14］常全忠，張淑玲，尹金寶，等.氯通道阻斷劑對(duì)NO誘導(dǎo)離體大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的保護(hù)作用［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2009，25(9):1197-200.

［14］Chang Q Z，Zhang S L，Yin J B，et al.The protective effects of chloride channel blockers on the cultured hippocampal neuronal apoptosis induced by NO in rats［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(9):1197-200.