韓懿嵐，王思明，李曉峰，董 玫，路新華，3，史清文，叢 斌，谷建平

(河北醫(yī)科大學(xué)1.法醫(yī)學(xué)系，2.藥學(xué)院，天然藥物化學(xué)教研室，河北石家莊 050017;3.華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司微生物藥物國家工程研究中心，河北石家莊 050015)

腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，占全部腦腫瘤的45% ～55%。目前，包括手術(shù)、放射治療和綜合治療等主要治療措施已取得長足進(jìn)步，但由于膠質(zhì)瘤浸潤性生長，與周圍腦組織無明顯分界且易于復(fù)發(fā)，其療效均不甚理想，因此，從植物和微生物中尋找高效抗癌的新化合物和新作用靶點(diǎn)已成為國際新藥研發(fā)的熱點(diǎn)。山酮(Xanthones)是一類能幫助捕獲并中和自由基，從而祛除自由基的植物型多酚，具有抗瘧、抗癌、抗氧化和抗炎等活性［1］。本研究首次檢測(cè)了3種山酮類化合物抑制人腦腫瘤細(xì)胞增殖的效應(yīng)，并進(jìn)一步選取與細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白p53和Bax為研究對(duì)象，探討山酮類化合物誘導(dǎo)人腦腫瘤細(xì)胞增殖的分子生物學(xué)機(jī)制，為研發(fā)新的抗腫瘤藥物及臨床應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1藥品和試劑從微生物次生代謝產(chǎn)物中純化的3種山酮類化合物1'-hydroxy Austocystin D(1)［2］、Austocystin D(2)［3］和 Austocystin H(3)［3］由華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司提供，經(jīng)HPLC和1H-NMR檢查，純度在99%以上(Fig 1)。噻唑藍(lán)(MTT，美國 Sigma公司，M-2128);RPMI 1640培養(yǎng)基(美國，Gibco);順鉑(美國 Sigma，034k3693);質(zhì)粒p53報(bào)告基因(pG53-Luc)、Bax報(bào)告基因(pGBax-Luc)和內(nèi)參照基因(SV-40-Rluc)由日本千葉大學(xué)醫(yī)學(xué)部第一生物化學(xué)研究室提供。

Fig 1 Chemical structures of 1'-hydroxy Austocystin D，Austocystin D and Austocystin H

1.2細(xì)胞系人原發(fā)性腦腫瘤細(xì)胞(T-98和U251SP)和繼發(fā)性腦腫瘤細(xì)胞(KT)由日本千葉大學(xué)醫(yī)學(xué)部第二生物化學(xué)研究室提供。各細(xì)胞接種于直徑為100 mm的培養(yǎng)皿中，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，37℃和5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1MTT法［4］將3種人腦腫瘤細(xì)胞懸浮接種于96孔板，每孔90 μl(含1×104個(gè)細(xì)胞)，分別加入溶劑對(duì)照(終濃度0.1%DMSO)、陽性對(duì)照順鉑和終濃度為100、10 和1 μmol·L-1的3 種山酮化合物各10 μl，每組均設(shè)3復(fù)孔，置于飽和濕度、37℃和5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。于培養(yǎng)結(jié)束前4 h，各培養(yǎng)孔加入5 g·L-1的MTT 10 μl，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各孔吸光度值(OD值)，并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，細(xì)胞增殖抑制率/%=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Origin 7.0軟件進(jìn)行處理，受試藥物對(duì)細(xì)胞的濃度-效應(yīng)曲線用Hill數(shù)學(xué)模型擬合，計(jì)算藥物的IC50值。

1.3.2熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)［5］KT細(xì)胞以每孔5×104個(gè)細(xì)胞接種于24孔板中，用含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞24 h，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗細(xì)胞兩次。取500 ng熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒pG13-Luc和pGBax-Luc以及5 ng內(nèi)參照基因質(zhì)粒SV-40-Rluc與1.2 μg脂質(zhì)體共同加入0.6 ml無血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，混勻室溫孵育30 min后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)孔中。于37℃和5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h。棄去轉(zhuǎn)染液，更換含有終濃度為5 μmol·L-1的陽性對(duì)照順鉑和Austocystin H的10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞24 h后，棄去培養(yǎng)液，用1×PLB(passive lysis buffer)裂解細(xì)胞后，立即上機(jī)檢測(cè)，記錄報(bào)告基因pG53-Luc和pGBax-Luc熒光素酶與內(nèi)參照基因SV-40-Rluc熒光素酶活性的比值。

1.3.3Western blot檢測(cè)［7］取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，按2×106個(gè)細(xì)胞/培養(yǎng)皿接種KT細(xì)胞。加入含有終濃度為5 μmol·L-1的陽性對(duì)照順鉑和Austocystin H的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24 h，離心收集細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞后，加入上樣緩沖液100 μl，劇烈震蕩后冰浴下超聲波處理1 min。100℃加熱3 min使蛋白質(zhì)變性，15 000 r·min-1離心15 min，取上清液測(cè)定蛋白濃度。取50 μg蛋白在SDS-PAGE電泳下分離，分離膠為12%，濃縮膠為5%。根據(jù)預(yù)染的蛋白Marker指示，小心割取GR所在的區(qū)帶，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜，用5%脫脂奶粉于室溫下?lián)u動(dòng)封閉膜1 h。膜在抗p53多克隆抗體(1∶1 000)和抗Bax多克隆抗體(1∶1 000)稀釋液中室溫過夜，1×TBS-T洗膜15 min，共3次后，在二抗稀釋液(抗鼠1∶20 000)中孵育20 min。再次洗膜后加入ECL試劑，反應(yīng)5 min，用X線曝光1～10 min后，顯影。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)用±s表示。兩組間數(shù)據(jù)用t檢驗(yàn)。應(yīng)用The SAS system 6.12統(tǒng)計(jì)軟件分析。

2 結(jié)果

2.13種山酮類化合物對(duì)人腦腫瘤細(xì)胞增殖的影響結(jié)果如Fig 2所示，陽性對(duì)照順鉑對(duì)3種人腦腫瘤細(xì)胞的增殖顯示中等程度的抑制活性，IC50分別為 11.26、12.38 和 34.67 μmol·L-1;Austocystin H對(duì)T-98和U251SP細(xì)胞的增殖顯示與陽性對(duì)照順鉑相近的抑制活性，但對(duì)KT細(xì)胞的增殖顯示極強(qiáng)的抑制活性，10和100 μmol·L-1劑量組與空白對(duì)照相比差異均有顯著性，呈劑量依賴性，IC50僅為0.69 μmol·L-1;1'-hydroxy Austocystin D 和Austocystin D對(duì)3種人腦腫瘤細(xì)胞的增殖均不顯示抑制活性，IC50均大于 100 μmol·L-1。

2.2Austocystin H對(duì)KT細(xì)胞內(nèi)p53和Bax報(bào)告基因表達(dá)的影響使用5 μmol·L-1的順鉑和Austocystin H處理KT細(xì)胞后，觀察其對(duì)KT細(xì)胞報(bào)告基因表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，5 μmol·L-1的陽性對(duì)照順鉑可誘導(dǎo)KT細(xì)胞內(nèi)p53和Bax報(bào)告基因的表達(dá)(P＜0.01)，分別為空白對(duì)照的2.94倍和4.66倍;5 μmol·L-1的 Austocystin H 可使 KT細(xì)胞內(nèi)Bax報(bào)告基因增強(qiáng)(P＜0.01)，為空白對(duì)照的5.61倍(Fig 3A)。

2.3Austocystin H對(duì)KT細(xì)胞內(nèi)p53和Bax蛋白的上調(diào)作用為了進(jìn)一步探討Austocystin H對(duì)KT細(xì)胞內(nèi)p53和Bax蛋白的影響，使用5 μmol·L-1的順鉑和Austocystin H處理KT細(xì)胞24 h后，通過Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)p53和Bax蛋白的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如Fig 3B所示，Austocystin H作用KT細(xì)胞后，可上調(diào)KT細(xì)胞內(nèi)的p53和Bax蛋白表達(dá)。

3 討論

目前癌癥的化學(xué)治療已取得很大進(jìn)步，但是由于腦部存在血腦屏障的特殊結(jié)構(gòu)，腦腫瘤的化學(xué)治療仍受到許多限制，而且化療藥物只能通過藥物的脂溶性通過血管內(nèi)膜，進(jìn)入腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生作用，這樣的模式影響了藥物作用的速度與效率，而且在傳統(tǒng)的全身系統(tǒng)化學(xué)治療中，藥物劑量較大，但腫瘤局部藥物濃度較低，易造成嚴(yán)重的肝臟損害及骨髓抑制，往往由于抗腫瘤藥物的毒副反應(yīng)較重而不得不放棄化學(xué)治療［6］。

本實(shí)驗(yàn)首次選用從微生物次生代謝產(chǎn)物中純化的3種山酮類化合物1'-hydroxy Austocystin D，Austocystin D和Austocystin H為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，觀察了3種山酮類化合物對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的抑制活性。結(jié)果顯示，Austocystin H對(duì)T-98和U251SP細(xì)胞的增殖與陽性對(duì)照順鉑有相近的抑制活性，但對(duì)KT細(xì)胞的增殖有極強(qiáng)的抑制活性。

Fig 2 The effect of three xanthones for experiment on the proliferation of glioma cell lines

Fig 3 The molecular mechanism of Austocystin H on KT cells

報(bào)告基因是一種易于檢測(cè)蛋白質(zhì)或酶等表達(dá)產(chǎn)物的基因。把報(bào)告基因的編碼序列和基因表達(dá)調(diào)節(jié)序列融合形成嵌合基因，或與其它目的基因融合，在調(diào)控序列控制下進(jìn)行表達(dá)，通過報(bào)告基因的表達(dá)產(chǎn)物來標(biāo)定目的基因的表達(dá)狀況。由于報(bào)告基因技術(shù)具有靈敏度高和檢測(cè)方便等特點(diǎn)，已被廣泛的應(yīng)用在藥物篩選等領(lǐng)域［7］。本實(shí)驗(yàn)利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)方法，觀察了Austocystin H對(duì)與細(xì)胞凋亡有關(guān)的報(bào)告基因的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Austocystin H可使KT細(xì)胞內(nèi)Bax報(bào)告基因增強(qiáng)，進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，Austocystin H可誘導(dǎo)KT細(xì)胞內(nèi)的p53和Bax蛋白表達(dá)上調(diào)。根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們推測(cè)Austocystin H引起KT細(xì)胞p53表達(dá)水平的增加，p53與Bax啟動(dòng)子中p53的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，從而上調(diào)Bax的表達(dá)水平，因此最終啟動(dòng)下游凋亡因子，而導(dǎo)致KT細(xì)胞凋亡。

由于促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡是多途徑共同作用的結(jié)果，因此Austocystin H誘導(dǎo)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制還需要進(jìn)一步研究，從而為開發(fā)新的抗人腦膠質(zhì)瘤藥物及臨床應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

［1］邢 丞，徐 波，郭 維，等.1-羥基-2，3，5-三甲氧基Ⅱ山酮對(duì)脂多糖致小鼠急性肺損傷的保護(hù)作用［J］.中草藥，2007，37(9):1355-9.

［1］Xing C，Xu B，Guo W，et al.Protection of 1-hydroxy-2，3，5-trimethoxyxanthone on acute lung injury of mice induced by lipopolysaccharjde［J］.Chin Traditional Herb Drug，2007，37(9):1355-9.

［2］Horak R M，Steyn P S，Vleggaar R.Biosynthesis of Austocystin D in Aapergillus ustus.A carbon-13 nuclear magnetic resonance study［J］.J Chem Soc Perkin Trans，1983，8:1745-8.

［3］Steyn P S，Vleggaar R.Austocystins.Six novel dihydrofuro(3'，2':4，5)furo(3，2-b)xanthenones from Aspergillus ustus［J］.JChem Soc［Perkin1］.1974，19:2250-6.

［4］司徒鎮(zhèn)強(qiáng).細(xì)胞培養(yǎng)［M］.北京:世界圖書出版社，1996:134-8.

［4］Situ Z Q.Cell Culture［M］.Beijing:World Book Publishing Company，1996:134-8.

［5］Natsuko S，Toshifumi K，Takeshi K，et al.Activation of NFAT signal by p53-K120R mutant［J］.FEBS Lett，2009，583:1916-22.

［6］羅海洋，錢鎖開.腦膠質(zhì)瘤臨床治療進(jìn)展［J］.實(shí)用臨床醫(yī)學(xué)，2008，9(2):120-2.

［6］Luo H Y，Qian S K.Progress in the therapy of glioma［J］.Practical Clin Med，2008，9(2):120-2.

［7］杜彥梅，單寶恩.報(bào)告基因熒光素酶在科研中的應(yīng)用［J］.中華腫瘤防治雜志，2009，16(9):715-8.

［7］Du Y M，Shan B E.Reporter gene luciferase in application of scientific research［J］.Chin J Cancer Prevent Treat，2009，16(9):715-8.