楊志霞，林 謙，馬 利，孫中成，李斐斐，李根茂，葛冬宇

(1.北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院心內科，北京 100078;2.北京中醫(yī)藥大學研究生院，3.北京中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，北京 100029)

心力衰竭是心血管疾病的主要死因。心臟的自身神經-內分泌-能量代謝-免疫網絡調節(jié)可能是心衰時心室擴大和功能異常的重要機制。CHF時存在細胞因子網絡的紊亂。近年來發(fā)現(xiàn)MIF作為前炎癥細胞因子，可誘導T淋巴細胞、自然殺傷細胞(NK)產生 IFN-γ，促進 TNF-α、IL-6 和粒-單集落刺激因子(GM-CSF)等炎性因子的表達，通過抑制心肌收縮力，引起心肌重塑及心肌細胞凋亡，是導致心衰發(fā)生的一個新的炎性指標［1］。《黃帝內經》記載:“正氣存內，邪不可干，邪之所湊，其氣必虛。虛久必瘀”。本課題基于氣虛血瘀導致心衰的理論，探索益氣活血中藥的單體提取物—黃芪多糖聯(lián)合丹參酮對CHF關鍵性炎性細胞因子TNF-α、IL-6的上游調控因子——MIF的干預效應，為臨床治療CHF探索新思路新方法。

1 材料與方法

1.1材料與試劑丹參酮Ⅱ-A(上海第一生物制藥廠，批號100603);黃芪多糖(廣東惠州東方植物科技有限公司);阿托伐他汀片(德國輝瑞制藥有限公司，批號J20070060);PCR引物(大連寶生物工程);逆轉錄試劑盒(美國 Qiagen公司);Rat MIF(RB公司，批號3R069);TNF-α、IL-6雙抗體夾心ELISA試劑盒(北京四正柏生物科技公司);切片機(LEITZ WETZLAR GERMANY 1516);顯微鏡(日本Olympus);照相系統(tǒng)(801.Nikon eclipse);IS-ElementsBR2.0圖像分析系統(tǒng)(日本Nikon公司);PCR儀(Bioer XP CycleC);Transiliuminator凝膠成像儀;全自動多功能酶標儀(506000001，SAFIREⅡ);電熱恒溫培養(yǎng)箱(DH4000A，天津泰斯特);半自動洗板機(Thermo，USA)。♂ SD大鼠，體質量(200±50)g，由北京維通利華實驗動物中心提供。

1.2慢性心衰大鼠模型的建立采用冠狀動脈結扎術方法［2］:麻醉固定備皮后行氣管插管連小動物呼吸機，行正壓人工呼吸(潮氣量7～8 ml，呼吸頻率80次·min-1)，并描記大鼠正常心電圖。消毒后，沿胸骨左側第3、4肋間隙開胸，用眼科小鑷子輕提并剪開心包膜，暴露心臟用無菌齒鑷輕提左心耳，暴露主動脈根部，線繞過冠狀動脈(心上緣)結扎心肌組織2～3 mm，打2個死結，以縫線下心肌色澤變淺、蒼白，同時心電監(jiān)護見肢導R波振幅及ST段明顯升高，為結扎成功?？p合胸壁，皮下注射青霉素80萬IU、速尿0.2 ml、利多卡因0.2 ml，待恢復自主呼吸后撤離呼吸機。

1.3一般觀察及超聲心動圖檢查術后4 h常規(guī)飼養(yǎng)食水。第2周飼料減半。第3周游泳20 min·(次·d)-1。第4周麻醉后備皮，大鼠取仰臥位。應用VEVO7.0超聲顯像儀行超聲多普勒心電圖檢查，將成模大鼠納入實驗組。

1.4實驗分組及給藥方案將成模后大鼠分為模型組、黃芪多糖組(APS，3 g·kg-1·d-1)、丹參酮組(Tan，5 mg·kg-1·d-1)、黃 + 丹組(劑量同上)、阿托伐他汀組(Atorvastatin，10 mg·kg-1·d-1)及假手術組(Sham)，各給藥組分別給予相應體積的藥物，連續(xù)給藥6 wk。

1.5心肌病理形態(tài)學檢查大鼠活殺后開胸剪下心臟，取心尖部心肌，以4℃冷生理鹽水沖洗干凈。用4%多聚甲醛溶液固定。組織固定48 h后常規(guī)脫水、石蠟包埋，6 μm間斷連續(xù)切片、HE染色，光鏡下觀察。

1.6RT-PCR法檢測心肌MIFmRNA取50～100 mg左心室心肌組織勻漿，TRIzol抽提總RNA，紫外分光光度計測定濃度及純度。4 μl RNA加到12.5 μl反轉錄反應體系中，按RT-PCR試劑盒說明書操作合成 cDNA。1 μl cDNA、0.5 μl引物加入到20 μl擴增反應體系中，使用PCR擴增儀合成DNA。見Tab 1。

Tab 1 PCR reaction program

產物長度 Rat Actin 380 bp，Rat MIF 406 bp。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色、照相并經光密度儀掃描分析，以Actin灰度值進行標準校正，計算MIF產物相對量。

1.7ELISA法檢測血清MIF、TNF-α及IL-6水平麻醉后大鼠腹主動脈取血，干凈促凝管中室溫凝固0.5 h后1 000×g離心15min，收集血清并分裝。按ELISA試劑盒說明書操作檢測血清MIF、TNF-α及IL-6水平。

1.8統(tǒng)計學分析應用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料用±s表示，組間差異比較采用one-way ANOVA，同時應用兩兩比較(SNK檢驗)。

2 結果

2.1心肌病理形態(tài)學檢查結果HE染色光鏡下顯示:假手術組可見心肌細胞核橫紋，未見變性、壞死細胞浸潤，心內膜及心外膜未見明顯異常(Fig 1A);模型組可見室壁局部不規(guī)則壞死灶，心肌纖維數量減少，殘余心肌染色變淺，橫紋模糊，部分壞死灶已被膠原纖維所構成的瘢痕組織替代，間質內有較多炎細胞浸潤，在心肌纖維之間有大量結締組織增生(Fig 1B);藥物組可見壞死灶內心肌纖維數量減少，殘余心肌細胞比模型組多，橫紋清晰，部分壞死灶已被膠原纖維的瘢痕組織替代，間質內有少量炎細胞浸潤(Fig 1C～F)。

2.2RT-PCR法檢測心肌MIF mRNA表達情況心肌組織PT-PCR結果顯示，各治療組心肌MIF mRNA表達較模型組均明顯降低，RT-PCR電泳產物灰度比值為:假手術組(0.410±0.105)，阿托伐他汀組(0.532±0.128)，黃 +丹組(0.621±0.123)，黃芪多糖組(0.720±0.205)，丹參酮組(0.795±0.188)，模型組(0.911±0.232)。模型組與假手術組，黃+丹組與黃芪多糖組、丹參酮組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P均＜0.05)。見Fig 2，3。

Fig 1 Histopathology of left ventricular in CHF rats(×40)

Fig 2 Expression of myocardial MIFmRNA by RT-PCR detection

Fig 3 Expression of myocardial MIFmRNA by RT-PCR detection

2.3 ELISA 法檢測血清 MIF、TNF-α、IL-6 表達的影響結果顯示，各治療組血清 MIF、TNF-α、IL-6的表達較模型組均明顯降低，而模型組與假手術組，黃+丹組與黃芪多糖組、丹參酮組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P均＜0.05)。見Tab 2。

Tab 2 Expression of serum MIF，TNF-α，IL-6 expression by ELISA detection(xˉ±s，n=5)

3 討論

心力衰竭是大多數心血管疾病的最終歸宿，也是最主要死因［3］。血清 IL-6、TNF-α的水平與心血管危險因素患者的生命衰竭有關［4］，可能通過下調肌漿網Ca2+-ATP酶，推遲舒張心肌細胞鈣離子的再吸收和衰減，導致心臟舒張功能不全［5］?；钚匝蹩梢鹧趸瘧ふT導MIF分泌，損傷心肌細胞［6］，推測MIF可能在急性心肌梗死后心功能不全和心室重構中發(fā)揮作用［7］。MIF可誘導巨噬細胞分泌TNF-α，抑制神經體液興奮和心肌收縮力［8］。因此，MIF現(xiàn)已成為多種炎癥介質和細胞因子基因表達調控的關鍵因子。

《本草綱目》記載黃芪為補藥之長，黃芪多糖是其主要有效活性成分，可通過抑制人心臟微血管內皮細胞的NF-κB信號通路，減少炎癥細胞因子的表達［9］。丹參酮Ⅱ-A是丹參的主要有效成分，其抑制血小板黏附、聚集及血栓形成的作用，可能與其抑制肌動球蛋白激活的Mg2+-ATP酶活性有關［10］。他汀類藥物具有多重心血管保護作用，能有效抑制心肌肥厚及心室重構，延緩心衰整個病程［11］。本實驗采用黃芪多糖聯(lián)合丹參酮對CHF大鼠細胞因子的活化進行干預，通過病理組織學、RF-PCR法及ELISA法，證實益氣活血中藥對大鼠心肌組織MIF活化及血清MIF、TNF-α、IL-6表達均具有明顯的治療作用，且療效優(yōu)于單一用藥組，其作用機制可能與抑制基因表達、細胞生長及凋亡，阻斷左室重構，從而延緩心衰發(fā)生發(fā)展有關，中西醫(yī)結合從心衰-氣虛血瘀證-免疫調節(jié)-細胞因子網絡調控的角度，進行多層次多靶點的干預，針對抗MIF活化的免疫調節(jié)中藥有望成為CHF治療新靶點。

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