于玲菲，李婕，李丹，楊寧，寧宏

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科，沈陽(yáng) 110001）

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥之一，在發(fā)達(dá)國(guó)家已成為成年人失明的主要原因，其發(fā)生發(fā)展可能與某些生長(zhǎng)因子有關(guān)。單核細(xì)胞趨化蛋白1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1） 是由內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和單核細(xì)胞分泌的一種趨化因子，是作用于單核細(xì)胞的特異的強(qiáng)趨化蛋白。近年來(lái)MCP-1在DR發(fā)生發(fā)展中所起的作用日益受到重視［1］。普伐他汀是3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（3-hydroxy-3-methylglutaryle-CoA，HMGCoA）還原酶抑制劑，臨床上用于治療脂代謝異常，它除了能降低膽固醇外，還能夠抑制細(xì)胞外基質(zhì)形成、抗氧化、抑制炎性反應(yīng)、抑制膠原纖維增生，還可以改善血管內(nèi)皮的屏障功能［2，3］。另有研究證實(shí)，普伐他汀對(duì)糖尿病腎病有治療作用［4］。糖尿病腎病與DR同為糖尿病的微血管病變，因此，我們推測(cè)普伐他汀可能通過(guò)細(xì)胞因子的調(diào)控對(duì)DR的內(nèi)皮細(xì)胞損害、細(xì)胞外基質(zhì)積聚起改善作用。本研究通過(guò)觀察普伐他汀對(duì)2型糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織中MCP-1表達(dá)的變化，探討普伐他汀治療或預(yù)防DR發(fā)生的新途徑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量180～200 g，購(gòu)自遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部。隨機(jī)分為正常組、糖尿病組和普伐他汀治療組3組。其中糖尿病組和普伐他汀治療組大鼠以60 mg/kg一次性腹腔注射2%鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ），使用前以 0.5 mmol/L 的枸櫞酸－枸櫞酸鈉緩沖液（pH4.5）配制。大鼠自由進(jìn)食水。注射后48 h采尾血測(cè)血糖及尿糖，將血糖濃度＞16.7 mmol/L、尿糖陽(yáng)性的Wistar大鼠定為糖尿病鼠［5］。

取成模糖尿病大鼠36只（包括糖尿病組和普伐他汀治療組各18只），正常組大鼠18只。正常組和糖尿病組大鼠喂正常飼料，普伐他汀治療組大鼠喂正常飼料的同時(shí)按100 mg·kg－1·d－1喂入普伐他汀［8］。喂養(yǎng)30周后處死全部大鼠，取出每只大鼠1眼的視網(wǎng)膜，立即置液氮中凍存，另1眼去除眼前節(jié)后置于25 ml/L戊二醛溶液，4℃固定2 h，乙醇梯度脫水，石蠟包埋。

1.2 主要試劑和儀器

普伐他汀片（默沙東公司）；鏈脲佐菌素（Sigma公司）；MCP-1多克隆抗體、即用型SABC免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒（棕黃色）（武漢博士德公司）；胰蛋白酶（Sigma公司）；RT-PCR試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司）；顯微圖像分析系統(tǒng)（UIC/ROPER/OLYMPUS，Metamorph/Coolsnafx/Ax70型）。

1.3 免疫組化SABC法檢測(cè)各組視網(wǎng)膜組織中MCP-1的表達(dá)

每個(gè)石蠟標(biāo)本制成5μm厚連續(xù)切片3張。1張行HE染色，1張做MCP-1免疫組化研究，另1張作為PBS取代MCP-1一抗的陰性對(duì)照。對(duì)照組標(biāo)本切片作為正常對(duì)照。已知MCP-1染色陽(yáng)性的膀胱癌組織切片作為陽(yáng)性對(duì)照片。常規(guī)制備HE染色切片、MCP-1免疫組化染色切片。常溫晾置3 d，每張切片隨機(jī)選取視網(wǎng)膜后極部視野2個(gè)，40倍物鏡下照像，轉(zhuǎn)存入計(jì)算機(jī)，用Metamorph軟件計(jì)算等大區(qū)域中MCP-1陽(yáng)性面積百分比及吸光度值（陽(yáng)性表達(dá)為細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色著色）。

1.4 常規(guī)RT-PCR和Real-time PCR檢測(cè)MCP-1 mRNA的表達(dá)

將凍存標(biāo)本機(jī)械勻漿后，采用異硫氫酸胍－酚－氯仿一步法提取標(biāo)本中的總RNA。紫外分光光度計(jì)下測(cè)A260和A280值，其A值均>1.9。采用First-Strand cDNA 合成試劑盒（Amersham Biosciences，美國(guó)）合成cDNA，操作按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行：8μl（1 μg）總RNA溶液65℃孵育10 min，迅速冷卻至0℃，再加入 DTT 溶液 1μl，Oligo（dt）18引物 1μl，F(xiàn)irst-Strand合成混合液5μl，37℃孵育60 min。

采用Real-time PCR法定量分析MCP-1 mRNA表達(dá)水平。引物及特異性探針序列由ABI公司（Applied Biosystems，美國(guó)）設(shè)計(jì)并合成。Real-time PCR擴(kuò)增在ABIPrism 7000系統(tǒng)（Applied Biosystems）上進(jìn)行。反應(yīng)總體積25μl，含相當(dāng)于150 ng總RNA的cDNA，1μmol/L各種上下游引物，1 U的Taq DNA聚合酶。擴(kuò)增條件：94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。以持家基因GAPDH作為內(nèi)對(duì)照，以等量cDNA中MCP-1與GAPDH mRNA表達(dá)值的比值作為各自基因mRNA表達(dá)的定量值。GAPDH擴(kuò)增采用TaqMan Rodent GAPDH Control Reagents VICTM Prove試劑盒（Applied Biosystems，美國(guó)）。

同時(shí)采用常規(guī)PCR法檢測(cè)MCP-1 mRNA表達(dá)。反應(yīng)總體積為50μl。引物序列為：MCP-1，上游5′ATGCAGGTCTCTGTCACG 3′，下游 5′CTAGTTCT CTGTCATACT 3′；GAPDH，上游 5′TGAACGGGAAG CTCACTGG 3′，下游 5′TCCACCACCCTGTTGCTGTA 3′。擴(kuò)增條件：GAPDH，94 ℃ 1 min，，62 ℃ 1 min，72℃ 1 min，35 個(gè)循環(huán)；MCP-1，94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72℃1 min，37個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中電泳，照相。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS13.0軟件包對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)用x±s表示，所有資料的比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中MCP-1的表達(dá)（圖1）

MCP-1陽(yáng)性表達(dá)主要為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞胞質(zhì)呈棕黃色。與正常組相比，糖尿病組視網(wǎng)膜變薄，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)目減少，而普伐他汀治療組視網(wǎng)膜形態(tài)無(wú)明顯改變。與正常組相比，糖尿病組MCP-1表達(dá)明顯增強(qiáng)，A值明顯增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而普伐他汀治療組MCP-1表達(dá)稍有增強(qiáng)，A值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。普伐他汀治療組MCP-1表達(dá)較糖尿病組減弱，A值降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中MCP-1 mRNA的表達(dá)

圖1 2型糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織中M C P-1免疫組化結(jié)果 ×40Fig.1 Expression of M C P-1 in the retina of rat model of type 2 diabetes×40

PCR結(jié)果（圖2）顯示，與正常對(duì)照組比較，糖尿病組視網(wǎng)膜組織中MCP-1 mRNA表達(dá)水平明顯增高，而普伐他汀治療組MCP-1 mRNA表達(dá)稍有增強(qiáng)。普伐他汀治療組MCP-1 mRNA表達(dá)明顯弱于糖尿病組。Real-time PCR結(jié)果（圖3）顯示，以MCP-1/GAPDH比值代表MCP-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量，與正常組相比，糖尿病組視網(wǎng)膜組織中MCP-1 mRNA表達(dá)量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；普伐他汀治療組MCP-1 mRNA表達(dá)量與正常組相比稍有升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），與糖尿病組相比明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

圖2 M C P-1 m RNA在各組大鼠視網(wǎng)膜組織中的表達(dá)Fig.2 Expression of M C P-1 m RNA in rat retina in each group

圖3 M C P-1 m RNA在各組大鼠視網(wǎng)膜組織中表達(dá)水平的定量分析Fig.3 Q uantitative analysis of the expression of M C P-1 m RNA in rat retina in each group

3 討論

近年的研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病視網(wǎng)膜病變（DR）的發(fā)生發(fā)展與某些生長(zhǎng)因子的過(guò)度表達(dá)有關(guān)。被MCP-1趨化激活的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞可產(chǎn)生轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β、腫瘤壞死因子，破壞血－視網(wǎng)膜屏障，提高視網(wǎng)膜血管通透性，刺激血管外基質(zhì)過(guò)度增生，導(dǎo)致視網(wǎng)膜新生血管的產(chǎn)生［9］，促進(jìn)DR的發(fā)生發(fā)展。因此，有效地抑制視網(wǎng)膜組織中MCP-1的表達(dá)，對(duì)預(yù)防和延緩DR發(fā)生、發(fā)展可能具有重要的作用。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，糖尿病組大鼠視網(wǎng)膜組織較正常組變薄，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞減少，而普伐他汀治療組視網(wǎng)膜形態(tài)與正常組相比無(wú)明顯差別，這表明普伐他汀能夠阻止糖尿病引起的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)減少，進(jìn)而阻止視網(wǎng)膜組織損傷。普伐他汀可以改變糖尿病鼠視網(wǎng)膜微血管，這在我們之前的研究中已經(jīng)證實(shí)［8］。

本研究中免疫組化和RT-PCR檢測(cè)結(jié)果均顯示，糖尿病組大鼠視網(wǎng)膜組織中MCP-1的表達(dá)顯著增高，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［1］，提示MCP-1參與了糖尿病鼠視網(wǎng)膜組織代謝，可能在DR的發(fā)生中起重要作用。其機(jī)制可能為長(zhǎng)期的高血糖刺激視網(wǎng)膜組織中內(nèi)皮細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生MCP-1，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)，損害視網(wǎng)膜；MCP-1同時(shí)誘導(dǎo)單核細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)黏附因子，增加白細(xì)胞的黏附，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷與壞死，血－視網(wǎng)膜屏障破壞，血管通透性增加，組織缺血、缺氧加重，新生血管形成［9］。另外，過(guò)度表達(dá)的黏附分子與白細(xì)胞共同作用，黏附于血管內(nèi)皮細(xì)胞表面，形成小栓子，堵塞小血管，導(dǎo)致血管閉塞，發(fā)生進(jìn)一步血管損傷［9］。

本研究還發(fā)現(xiàn)，普伐他汀治療組大鼠視網(wǎng)膜組織中MCP-1的表達(dá)雖然比正常組稍有增強(qiáng)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與糖尿病組相比則明顯減弱，提示普伐他汀能夠抑制MCP-1的表達(dá)。因此我們不難推斷普伐他汀可能是通過(guò)抑制DR發(fā)生的關(guān)鍵因子—MCP-1來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)2型糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變的阻止作用的。

綜上所述，普伐他汀可阻止2型糖尿病大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞減少，抑制2型糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織MCP-1的表達(dá)。普伐他汀這一臨床常用藥在DR的預(yù)防及治療上可能有廣泛的應(yīng)用前景，這仍有待于進(jìn)一步的臨床試驗(yàn)證實(shí)。

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