趙成廣，鄧天麟，吳玉斌*

腎小管上皮細胞轉分化(EMT)是腎間質纖維化的重要環(huán)節(jié)。腎間質纖維化時，約36%的成纖維細胞來源于腎小管局部EMT［1］。轉分化的細胞以失去上皮細胞的標志物CK-18和出現(xiàn)間充質細胞標志物α-SMA為標志。EMT過程涉及腎小管基底膜的破壞及細胞增殖［2-3］，金屬蛋白酶 9(MMP9)降解腎小管基底膜的Ⅳ型膠原，有利于轉分化后的腎小管上皮細胞遷移到腎間質，通過增殖，加劇腎纖維化。近年來發(fā)現(xiàn)，表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigallocatechin-3-gallate，EGCG)具有抗肝纖維化的作用［4-6］，EGCG是否對腎臟腎小管上皮細胞轉分化有抑制作用尚無報道。本實驗采用EGCG干預TGF-β1誘導的大鼠腎小管上皮細胞株NRK細胞，通過檢測CK-18、α-SMA及細胞中MMP9、細胞周期素(Cyclin)D1的表達改變，探討EGCG對NRK細胞轉分化的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 實驗細胞:大鼠腎小管上皮細胞株(NRK-52E)，購于中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。L-EGCG購于 Sigma公司。TGF-β1購于 Peprotech 公司。α-SMA、CK-18、MMP9、Cyclin D1兔抗大鼠IgG(一抗)購于Santa Cruz公司。PrimeScriptTMRT Reagent Kit、Real time quantitive PCR(SYBRRPremix Ex TaqTM)試劑盒購于大連寶生物工程有限公司)。PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.2 試驗方法 腎小管上皮細胞培養(yǎng)與分組:NRK-52E大鼠腎小管上皮細胞株常規(guī)培養(yǎng)，經無血清的DMEM培養(yǎng)基同步化作用24 h，之后將培養(yǎng)的細胞隨機分為4組:1組:正常對照組(N)，以DMEM培養(yǎng)液為空白對照。2組:TGF-β1誘導組(培養(yǎng)液中TGF-β1的濃度為10 ng/mL)。3組:EGCG 200 μg/L 干預組，培養(yǎng)液中 TGF-β1的濃度為10 ng/mL，EGCG 濃度為 200 μg/L。4組:EGCG 400 μg/L 干預組，培養(yǎng)液中 TGF-β1的濃度為10 ng/mL，EGCG濃度為400 μg/L。各細胞組在作用48 h后收集細胞待測。

1.3 細胞爬片免疫組化測定 取1、2、3組同時進行細胞爬片，48 h后先PBS洗滌，再4%多聚甲醛固定，置于-20℃冰箱保存待測。采用免疫組化檢測α-SMA和CK-18，每組圖片取8個視野，采取日本OLYMPUS攝像系統(tǒng)和日本MetaMorph/BX41圖像數(shù)據分析系統(tǒng)測定平均光密度值。平均光密度值越大，代表樣本中目的蛋白含量越多。

1.4 細胞Western-blot分析 提取胞漿蛋白，按照Western-blot標準過程操作，檢測指標為Cyclin D1，MMP9蛋白。采用Flour Chem V 2.0凝膠成像分析軟件(America)進行吸光度掃描分析，結果以同一張膜上的β-actin作為內參，以目的蛋白與內參的吸光度比值代表目的蛋白含量的多少，比值越大，說明目的蛋白越多。

1.5 實時熒光定量PCR法測Cyclin D1、MMP9mRNA的相對表達量 采用SYBR Green I熒光染料嵌合法，分別制作目的基因和管家基因(GAPDH)的標準曲線。利用標準曲線對樣品中的目的基因和管家基因分別進行定量。通過管家基因的校正，檢測各組目的基因的相對表達量。根據標準曲線，熒光定量PCR儀自動分析并計算結果，目的基因mRNA的相對表達量=目的基因拷貝數(shù)/GAPDH基因拷貝數(shù)，此數(shù)值越大表明樣本中目的基因含量越多。

引物序列:

Cyclin D1-F 5'-AACCACAAAGACGGAGATG-3'Cyclin D1-R 5'-CGGCGGCAAGAATG-3'MMP9-F 5'-ACCCTGCGTATTTCCATT-3'MMP9-R 5'-GCACCAGCGATAACCAT-3'GAPDH-F 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'GAPDH-R 5'-ATGGTGGTGAAGACGCCAGT-3'

1.6 統(tǒng)計學分析 應用SPSS15.0統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示，采用單因素方差分析，進行正態(tài)分布及方差齊性檢驗，各組間兩兩比較采用q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 NRK細胞CK-18、α-SMA蛋白表達的變化

正常對照組NRK細胞中CK-18高表達，α-SMA無表達;NRK細胞被TGF-β1誘導48 h后，胞漿中CK-18蛋白表達明顯減少，α-SMA蛋白出現(xiàn)了高表達;而NRK細胞被TGF-β1和EGCG聯(lián)合作用48 h后，胞漿中 CK-18蛋白表達減少不明顯，α-SMA蛋白表達較 TGF-β1誘導組少。見表 1，圖1～圖6。

表1 EGCG干預前后CK-18及α-SMA表達(平均積分光密度值)的變化(n=8，±s)

表1 EGCG干預前后CK-18及α-SMA表達(平均積分光密度值)的變化(n=8，±s)

注:*與對照組比較，P＜0.05;#與TGF-β1組比較，P＜0.05

組別 CK-18 α-SMA對照組0.671±0.024 0 TGF-β1誘導組 0.225±0.056* 0.857±0.045 EGCG干預組(200 μg/L) 0.531±0.078# 0.342±0.028*

圖1 對照組腎小管上皮細胞(NRK)CK-18表達情況(免疫組化，×400)

圖2 TGF-β110 ng/mL作用NRK細胞48 h后CK-18表達明顯減少(免疫組化，×400)

圖3 EGCG 200 μg/L+TGF-β110 ng/mL作用NRK細胞48 h后，CK-18表達無明顯減少(免疫組化，×400)

圖4 對照組NRK細胞基本無α-SMA蛋白(免疫組化，×400)

圖5 TGF-β110 ng/mL作用NRK細胞48 h后α-SMA蛋白出現(xiàn)高表達(免疫組化，×400)

圖6 EGCG 200 μg/L+TGF-β110 ng/mL作用NRK細胞48 h后α-SMA蛋白表達減少(免疫組化，×400)

2.2 NRK細胞Cyclin D1、MMP9蛋白及其mRNA表達變化 NRK細胞被TGF-β1誘導48h后，Cyclin D1、MMP9蛋白及其mRNA表達明顯升高;而NRK細胞經TGF-β1和EGCG聯(lián)合作用后，上述各指標較TGF-β1誘導組表達減少，并且EGCG濃度為400 μg/L時，比200 μg/L能進一步減輕上述蛋白及mRNA的表達。見表2、表3，圖7、圖8。

表2 EGCG干預前后Cyclin D1蛋白及其mRNA表達的變化(n=8，±s)

表2 EGCG干預前后Cyclin D1蛋白及其mRNA表達的變化(n=8，±s)

注:*與對照組比較，P＜0.05;#與TGF-β1組比較，P＜0.05

組別 Cyclin D1/actin Cyclin D1 mRNA/GADPH對照組0.19±0.02 0.034±0.005 TGF-β1誘導組 0.72±0.05* 0.110±0.009*EGCG干預組(200μg/L) 0.48±0.04# 0.068±0.005#EGCG干預組(400μg/L) 0.31±0.03# 0.045±0.003#

表3 EGCG干預前后MMP9蛋白及其mRNA表達的變化(n=8，±s)

表3 EGCG干預前后MMP9蛋白及其mRNA表達的變化(n=8，±s)

注:*與對照組比較，P＜0.05;#與TGF-β1組比較，P＜0.05

組別 MMP9/actin MMP9 mRNA/GADPH對照組0.45±0.05 0.002 5±0.000 3 TGF-β1誘導組 1.11±0.04* 0.007 3±0.000 6*EGCG干預組(200μg/L) 0.94±0.03# 0.005 5±0.000 3#EGCG干預組(400μg/L) 0.78±0.02# 0.003 7±0.000 5#

3 討論

TGF-β1是一種公認的促纖維化因子［7］，可刺激上皮細胞向間充質細胞的轉化［8-9］。本實驗發(fā)現(xiàn)，TGF-β1誘導后的NRK細胞出現(xiàn)了α-SMA的表達，而CK-18表達減少，說明NRK細胞出現(xiàn)轉分化;而EGCG干預后上述變化減輕，說明EGCG能夠維持NRK細胞的上皮表型，減輕轉分化。

圖7 NRK細胞胞漿中Cyclin D1蛋白表達情況注:TGF-β1誘導組較對照組表達增加，EGCG干預組較誘導組表達減少，并且EGCG 400 μg/L組較200 μg/L減少更明顯(Western-blot)

圖8 NRK細胞胞漿中MMP9蛋白表達情況注:TGF-β1誘導組較對照組表達增加，EGCG干預組較誘導組表達減少，并且EGCG 400 μg/L組較200 μg/L減少更明顯(Western-blot)

上皮細胞轉分化為肌纖維細胞后，具有十分活躍的增殖和分泌細胞外基質的功能，通過增殖，肌纖維細胞數(shù)量增多，加劇了腎間質纖維化的過程［3］。細胞增殖通過細胞周期來實現(xiàn)，而細胞周期的運行則由Cyclin的周期性波動來調控。Cyclin D1是細胞周期調控網絡中的重要構成之一，其蛋白量的多少關系著細胞能否通過G1/S期的檢查點。Cyclin D1表達減少可使整個細胞周期停滯于G1期，而過表達可縮短G1期［10］，高表達促進細胞通過G0/G1期，在細胞增殖中發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤細胞中，EGCG能減少Cyclin D1的表達，誘導細胞周期的G1/S期阻滯，從而發(fā)揮抗增殖作用［11-12］。

本實驗發(fā)現(xiàn)，TGF-β1誘導的NRK細胞Cyclin D1蛋白及其mRNA表達明顯升高。Cyclin D1升高可促進轉分化后的細胞增殖，增加了肌成纖維細胞的數(shù)量，從而加重纖維化。給予 EGCG和TGF-β1聯(lián)合作用后，Cyclin D1蛋白及其mRNA表達明顯減少，提示EGCG能抑制轉分化細胞的增殖，從而減輕轉分化及纖維化。PCR結果說明，EGCG能從轉錄水平下調Cyclin D1蛋白的表達。EGCG 濃度為400 μg/L時，比200 μg/L能進一步減輕Cyclin D1蛋白及mRNA的表達，說明EGCG能以劑量依賴方式抑制Cyclin D1蛋白及其mRNA表達。

腎小管上皮細胞發(fā)生EMT過程中的關鍵步驟是腎小管基底膜的破壞，為轉分化的細胞遷移至腎間質提供基本條件［2］，腎小管基底膜主要成分為Ⅳ型膠原，MMP9和MMP2是其降解酶。Ⅳ型膠原維持腎小管上皮細胞的表型，而間質中的Ⅰ型膠原促進了EMT的發(fā)生［13］。可見基底膜的損傷破壞是啟動EMT不可缺少的環(huán)節(jié)。在多種腎間質纖維化模型中，MMPS/TIMPS比例失衡參與了腎間質纖維化的發(fā)生發(fā)展［14-15］;而在多種腫瘤細胞中，EGCG能減少MMP9的表達，而減輕腫瘤細胞的侵襲性［16-18］。本實驗發(fā)現(xiàn)，TGF-β1誘導 NRK 細胞后，MMP9蛋白及其mRNA發(fā)生上調，提示TGF-β1通過上調 MMP9的表達，降解基底膜，促進EMT的發(fā)生。在給予EGCG保護后，MMP9蛋白及其 mRNA發(fā)生下調，提示EGCG能通過抑制MMP9的表達而保護基底膜的完整性，起到減輕轉分化和纖維化的作用。EGCG濃度為400 μg/L時比200 μg/L能進一步減輕MMP9蛋白及mRNA的表達，說明 EGCG能以劑量依賴方式［19］抑制MMP9蛋白及mRNA的表達。

EGCG抑制MMP9、Cyclin D1蛋白及mRNA表達的機制尚不明確，可能與細胞內活性氧ROS有關。近年研究表明，ROS參與了細胞膜受體介導的信號轉導［20］。在哺乳動物細胞中，雖然不同的生長因子或細胞因子引發(fā)各自的信號轉導及細胞反應，但其作用幾乎均通過ROS這條共同通路來完成，因此，這些因子可引起細胞內ROS迅速升高;如果抑制ROS生成，則阻斷了外界刺激引起的相應的信號轉導，細胞增殖等功能受到抑制［21］，EGCG結構中富含酚羥基，容易被氧化成醌類而提供H+，因此，具有顯著的抗氧化活性和清除自由基的能力。張海燕［22］發(fā)現(xiàn)，ROS介導了 TGF-β1誘導的大鼠NRK細胞轉分化及細胞外基質聚集，推測EGCG可能通過抑制氧化還原信號傳導，從而下調Cyclin D1及MMP9的表達，進而發(fā)揮抑制細胞增殖和保護基底膜而減輕NRK轉分化的作用，這為臨床防治腎臟纖維化提供理論依據。

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