劉爭杰 趙自剛 趙永泉 牛春雨 張玉平 司永華 張立民

腸缺血再灌注(Ischemia/Reperfusion,I/R)引起的腸系膜上動脈閉塞性(Superior Mesenteric Artery Occlusion,SMAO)休克,是臨床常見的危重病理過程,常見于休克復蘇、器官移植術后、嚴重創(chuàng)傷救治過程等。研究表明,腸源性細菌內毒素經(jīng)腸淋巴途徑移位至全身是二次打擊、失血性休克導致多器官損傷的重要機制[1,2],腸淋巴液是危重病發(fā)展的橋梁[3,4]。以“腸缺血-再灌注”為基礎,將“夾閉腸系膜淋巴管(Mesenteric Lymph Duct,MLD)阻斷淋巴液回流1h,再行淋巴液灌注”稱為“腸淋巴再灌注”(Mesenteric Lymph Reperfusion,MLR);單純MLR對機體不造成損害,但可加劇SMAO休克這一病理過程中的多器官損傷,降低SMAO休克大鼠平均動脈壓及24h存活率[5],其機制與MLR加重多個器官的自由基損傷、一氧化氮釋放、組織細胞膜泵功能障礙有關[6]。為進一步探討MLR加重SMAO休克大鼠多器官損傷的作用機制,本文觀察了M LR對SMAO休克大鼠肺、心肌、腎、肝組織細胞間黏附分子-1(Intercellular Adhesion Molecule-1,ICAM-1)、晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(Receptor of Advanced Glycation End-Products,RAGE)含量的影響。

1 材料與方法

1.1 動物實驗方法

24只 SPF級 Wistar雄性大鼠(體重 280～330g,購自中國軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心)經(jīng)肌肉注射1%戊巴比妥鈉(50mg/kg體重,德國,北京化學試劑公司分裝,批號:071201)全身麻醉后,行右股部手術,分離股動脈與股靜脈,股動脈插管連壓力換能器接RM6240BD型生物信號采集處理系統(tǒng)(成都儀器廠)動態(tài)監(jiān)測平均動脈血壓,股靜脈給予肝素鈉溶液(1ml/kg體重,即500U/kg體重)全身抗凝;行腹部手術,暴露腸系膜根部,游離腸系膜上動脈(Superior Mesenteric Artery,SMA),仔細分離與SMA相伴行的MLD。血壓穩(wěn)定10min后進行下述操作并依次進行分組:Sham組:在SMA和MLD下穿線,不夾閉;SMAO組:以無創(chuàng)血管夾夾閉SMA根部 60min后,開夾再灌注120min,復制SMAO休克大鼠模型;MLR組:以無創(chuàng)血管夾夾閉MLD根部 60min后,開夾再灌注120min,實施 MLR;SMAO+MLR組:同時夾閉SMA和 MLD根部60min后,開夾再灌注120min。

1.2 取材與標本制備

所有動物經(jīng)再灌注120min、大量注射戊巴比妥鈉(120mg/kg體重)麻醉后(Sham組在相同時間點),迅速選擇固定位置,留取肺、心肌、肝、腎組織,放入無菌EP管,置于-80℃低溫冰箱(Forma-86C,美國熱電)冷藏。實驗前取出,加5倍量冷生理鹽水,用FJ-200型高速分散勻質機(上海標本模型廠)制備組織勻漿(濃度為 16.7%),使用 Labofuge 400R型高速低溫離心機(德國科峻)離心后留取上清,用于相關指標檢測。

1.3 指標檢測方法

采用ELISA測定各器官組織勻漿中ICAM-1、RAGE含量(試劑盒由美國R&D公司生產(chǎn)、江蘇希望生物科技有限公司代理),嚴格按照試劑盒說明書進行標準曲線制備、樣本測定;終止反應后,將酶標板放入酶標儀(Stat Fax-2100型,美國STAT-FAX公司)槽內,選擇450nm波長檢測其OD值,繪制標準曲線后,計算各樣本結果。各組織勻漿蛋白定量采用考馬斯亮藍法(試劑盒購自南京建成生物工程研究所)。

1.4 統(tǒng)計學處理

使用SPSS 16.0統(tǒng)計分析軟件包處理,計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示。首先進行方差齊性檢驗,方差齊(P＞0.10)的資料多組間比較采用單因素方差分析,組內自身比較應用配對t檢驗;方差不齊者(P≤0.10),采用Kruskal Wallis檢驗,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 MLR對SMAO休克大鼠各器官組織勻漿ICAM-1含量的影響

MLR組肺、腎、肝、心肌組織勻漿中的 ICAM-1含量與Sham組比較無統(tǒng)計學差異;SMAO組和SMAO+MLR組肺、腎、肝、心肌組織勻漿中ICAM-1含量高于Sham組及MLR組(P＜0.01),且SMAO+MLR組肺、腎、肝、心肌組織勻漿ICAM-1含量顯著高于SMAO組(P均＜0.01),見表1。

表1 MLR對SMAO休克大鼠各器官組織勻漿ICAM-1含量的影響(ng/g protein,±s,n均=6)

表1 MLR對SMAO休克大鼠各器官組織勻漿ICAM-1含量的影響(ng/g protein,±s,n均=6)

注:與Sham 組比較,1)P＜0.01;與M LR組比較,2)P＜0.01;與SM AO組比較,3)P＜0.01

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2.2 MLR對SMAO休克大鼠各器官組織勻漿RAGE含量的影響

由表2可見,MLR組與Sham 組肺、腎、肝、心肌組織勻漿中RAGE含量無顯著差異;SMAO組與SMAO+MLR組肺、腎、肝、心肌組織勻漿RAGE含量均顯著高于Sham組與M LR組(P＜0.01),且SMAO+MLR 組肺 、腎、肝 、心肌組織勻漿RAGE含量均顯著高于SMAO組(P＜0.01)。

表2 MLR對SMAO休克大鼠各器官組織勻漿RAGE含量的影響(ng/g protein,±s,n均=6)

表2 MLR對SMAO休克大鼠各器官組織勻漿RAGE含量的影響(ng/g protein,±s,n均=6)

注:與Sham 組比較,1)P＜0.01;與M LR組比較,2)P＜0.01;與SM AO組比較,3)P＜0.01

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3 討 論

隨著對腸淋巴系統(tǒng)在危重病發(fā)病學中作用的深入研究[3～8],現(xiàn)已認識到腸淋巴液回流參與了腸I/R后SMAO休克致遠隔器官的炎癥反應與組織損傷。Cavriani等[9]夾閉SMA 45min、開夾再灌注2h后發(fā)現(xiàn),腸I/R可致肺的多形核中性粒細胞(Polymerphonuclear Neutrophil,PMN)聚集、微血管通透性增高、炎癥介質水平升高;而結扎大鼠MLD可減輕腸I/R及其導致的肺損傷;Badami等[10]的研究也表明,結扎MLD可提高SMAO大鼠的存活率;Cox等[11]將犬腸缺血1h、再灌注3h,其心肌含水量較基礎值增高、等容舒張及-dp/dtmax顯著降低、PMN生成的過氧化產(chǎn)物增多、心肌髓過氧化物酶活性增強,而淋巴液轉流的犬,其腸I/R后心肌的上述各指標均接近基礎值,提示腸I/R所引起的心功能紊亂是由于淋巴液回流所引起。這些研究均表明,腸I/R后的腸淋巴液回流均參與了其后的遠隔器官炎癥和損傷。

本項目組在針對腸淋巴途徑與SMAO休克多器官損傷發(fā)病學的研究中發(fā)現(xiàn),SMAO休克的發(fā)生與有無MLR的影響有很大相關性,提示臨床在I/R損傷的防治策略中,應充分考慮腸淋巴途徑的發(fā)病學作用,在可能引起I/R損傷的諸多治療中,有效防止淋巴管擠壓及其后的再灌注,對預防I/R導致遠隔器官的損傷、提高治愈率可能是有效途徑之一[5,6,12]。鑒于MLR加重SMAO休克多器官損傷的作用機制與加劇炎癥反應有關,本研究從啟動炎癥反應的多個環(huán)節(jié),探討MLR加重SMAO休克器官炎癥反應的作用機制。

研究表明,PMN作為炎性因子釋放的炎細胞,在炎癥反應的網(wǎng)絡效應中起重要作用,因此,PMN扣押于組織,是組織器官炎癥反應失衡的重要因素[13]。本項目組在前期研究中發(fā)現(xiàn) MLR加重SMAO休克器官損傷的作用機制與髓過氧化物酶增高有關[6],提示MLR可引起PMN在組織器官的扣押;同時,由于ICAM-1表達上調可促使PMN和血管內皮細胞的黏附與激活,并跨越血管壁,穿出血管外,在組織中聚集和浸潤,引起局部組織釋放更多的炎癥介質[14],進一步加重組織損傷。本研究應用ELISA檢測各器官組織勻漿的ICAM-1水平后發(fā)現(xiàn),單純MLR組與Sham 組的肺、腎、肝、心肌組織ICAM-1含量無明顯變化,SMAO組肺、腎、心肌、肝組織ICAM-1含量顯著高于MLR和Sham組,SMAO+MLR組肺、腎、心、肝組織的ICAM-1含量顯著高于SMAO、MLR和Sham組,提示M LR可增加SMAO休克大鼠器官的ICAM-1含量,從而引起PMN扣押于組織增多,最終加重組織器官的炎癥反應。

Uchida等[15]研究發(fā)現(xiàn),RAGE是Ⅰ型肺泡上皮細胞損傷的一種標記物,與急性肺損傷相關;Van Zoelen等[16]在大腸桿菌性膿毒癥模型中發(fā)現(xiàn),未受損的RAGE信號通路有利于建立有效的抗菌防御體系;Unoshima等[17]在研究全身炎癥反應綜合征或膿毒血癥時發(fā)現(xiàn),脂多糖(LPS)所致急性肺損傷經(jīng)過抗體治療后(抑制RAGE表達),損傷癥狀基本消失;這些研究表明,RAGE在炎癥反應啟動過程中具有重要作用。本研究檢測各器官組織勻漿中RAGE的含量后發(fā)現(xiàn),SMAO組、SMAO+M LR組肺、腎、心肌、肝組織 RAGE含量均高于 MLR和Sham組,且 SMAO+MLR組RAGE含量高于SMAO組,提示MLR加重SMAO休克大鼠器官炎癥反應的機制與RAGE增多有關。

綜上所述,MLR可增加SMAO休克大鼠各器官的ICAM-1含量,成為PMN黏附、扣押于組織、加劇炎癥反應的主要機制;同時,MLR還增加SMAO休克大鼠各器官的 RAGE含量,成為炎癥反應加劇的又一因素。以腸淋巴途徑為研究靶點,對于SMAO休克后多器官損傷的防治具有一定的作用與意義。至于 RAGE通過哪一條途徑發(fā)揮MLR加重SMAO休克的炎癥反應過程,有待進一步探討。