朱 蘭 柳茂森 楊純英王 琪蔣 荷姚靜靜王立夫#

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院消化內(nèi)科1（200025） 浙江省臺(tái)州市中心醫(yī)院消化內(nèi)科2

近年，胰腺癌前病變胰腺上皮內(nèi)瘤變（pancreatic intraepithelial neoplasia,PanIN）中的異常分子遺傳學(xué)事件逐漸受到關(guān)注[1]。Kras基因第12位密碼子突變是胰腺癌發(fā)生、發(fā)展中的主要早期事件，而Smad4基因突變是主要晚期事件[2]。Smad4基因?qū)僖职┗?，可抑制胰腺癌?xì)胞增殖[3]。本課題組的前期研究成功構(gòu)建了 LoxP-Stop-LoxP-KrasG12D；Pdx1-Cre PanIN模型（第l2位甘氨酸突變?yōu)樘於彼幔?，分離并建立了早期PanIN細(xì)胞株[4,5]，并以RNA干擾技術(shù)成功沉默PanIN細(xì)胞的Smad4基因以獲取PanIN-S細(xì)胞株。本研究以PanIN細(xì)胞和PanIN-S細(xì)胞為研究對(duì)象，應(yīng)用小鼠全基因表達(dá)譜芯片篩查兩種細(xì)胞的基因表達(dá)譜差異，探討Smad4基因沉默致PanIN細(xì)胞增殖和惡性轉(zhuǎn)化的可能分子機(jī)制。

材料與方法

一、細(xì)胞株、主要試劑、儀器和基因芯片

PanIN細(xì)胞株為Kras基因突變小鼠基因打靶胰腺 PanIN 模型（LoxP-Stop-LoxP-KrasG12D；Pdx1-Cre小鼠[4]）經(jīng)體外建株獲得，基因突變分析示PanIN細(xì)胞可檢測(cè)到KrasG12D突變，但無p16、p53、Smad4等基因突變或缺失[5]。采用RNA干擾技術(shù)，慢病毒介導(dǎo)PanIN細(xì)胞內(nèi)源性Smad4基因沉默以建立PanIN-S細(xì)胞株。

Trizol（Invitrogen 公 司 ），RNeasy MiniKit（Qiagen 公司），aa-UTP（Ambion 公司），Cy3 NHS ester（GE Healthcare 公司），PrimeScriptTMRT reagent Kit、SYBR Premix Ex Taq （TaKaRa 公司），Low RNA InputFluorescentLinearAmplification Kit、Gene Expression Hybridization Kit、Gene Expression Wash Buffer Kit、Stabilization and Drying Solution、Microarray GasketSlide Kit、Microarray Hybridization Chamber Kits、2100生物分析儀、G2565BA微陣列掃描儀（Agilent公司）。

Agilent小鼠 4×44 K全基因表達(dá)譜芯片由上海伯豪生物技術(shù)有限公司提供，每張芯片代表小鼠基因組中所有已知基因和轉(zhuǎn)錄本，約含41174個(gè)小鼠基因和轉(zhuǎn)錄本。PanIN細(xì)胞和PanIN-S細(xì)胞各使用三張芯片。

二、方法

1.提取并純化總 RNA：Trizol提取細(xì)胞總RNA，260 nm和280 nm處測(cè)定吸光度（A）值以確定樣品濃度和純度。1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳，2100生物分析儀行質(zhì)檢，RNeasy Mini Kit純化總RNA。

2.aa-UTP標(biāo)記cRNA：采用第一鏈和第二鏈一步法逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA第二鏈為模板體外轉(zhuǎn)錄合成cRNA并行aa-UTP標(biāo)記。RNeasy Mini Kit純化cRNA。

3.cRNA樣品熒光標(biāo)記和純化：測(cè)定cRNA濃度，取 4μg cRNA 濃縮至 6.6μl，加入 DMSO 10μl、碳酸氫鈉（0.3 mol/L，pH 9.0）3.4μl以制備 cRNA混合液。取20μl混合液加入熒光染料（Cy3 NHS ester）25℃孵育1 h進(jìn)行標(biāo)記。加入hydroxylamine（4 mol/L） 9μl混勻，25 ℃孵育 15 min。 RNeasy Mini Kit純化cRNA。

4.芯片雜交和洗滌：取55μl混合液，60℃溫浴30 min 行片段化，加入 55μl緩沖液。取 100μl混合液上芯片，10 r/min 65℃滾動(dòng)雜交17 h，芯片洗滌。

5.芯片檢測(cè)和分析：微陣列掃描儀行芯片掃描，GeneSpring GX 10生物芯片數(shù)據(jù)分析軟件行結(jié)果分析，并行Quantile均一化處理。標(biāo)準(zhǔn)化后的信號(hào)值行差異倍數(shù)比較，篩選出差異倍數(shù)＞2的基因點(diǎn)。

6.實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR驗(yàn)證差異表達(dá)基因：Trizol提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。目的基因PCR引物由BioTNT公司合成（見表1）。PCR反應(yīng)體系為25μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃ 5 s，60℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)。目的基因表達(dá)量的分析采用 2-ΔΔCt法。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、RNA質(zhì)量鑒定

總 RNA A260/A280 比值為 1.91～2.02，l%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳可觀察到清晰的18 S和28 S條帶，說明RNA質(zhì)量良好，無降解。

二、基因芯片篩選結(jié)果分析

基因芯片掃描圖像背景均一，各點(diǎn)間距均勻相等，所獲圖像整體背景較低，信噪比較高。變異系數(shù)為2.44%～4.10%（變異系數(shù)在15%左右表示實(shí)驗(yàn)成功，越小表示重復(fù)性越好）?；蛐酒s交結(jié)果示差異倍數(shù)＞2的基因共237個(gè)，其中148個(gè)基因在PanIN-S細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，89個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，差異表達(dá)基因主要涉及細(xì)胞周期、增殖、凋亡、黏附、轉(zhuǎn)錄活性等。

表1 目的基因PCR引物序列和擴(kuò)增片段大小

進(jìn)一步對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)基因，包括細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）1、CDK2、CDK4、CDK6、細(xì)胞周期蛋白（cyclin）A、cyclin B、cyclin D、cyclin E、CDK 抑制劑 p15、p16、p18、p19、p21、p27 等進(jìn)行篩選，結(jié)果示PanIN細(xì)胞與PanIN-S細(xì)胞的p27、p19、cyclin D1基因表達(dá)存在顯著差異，差異倍數(shù)分別為 0.38、0.36 和 2.11。

三、基因芯片篩選結(jié)果驗(yàn)證

實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR結(jié)果示PanIN細(xì)胞與PanIN-S細(xì)胞間 p27、p19、cyclin D1基因表達(dá)存在顯著差異（P<0.05），差異倍數(shù)均值分別為0.41、0.39和1.82（見圖1），與基因芯片篩選結(jié)果一致。

圖1 兩組細(xì)胞p27、p19和cyclin D1相對(duì)表達(dá)量比較（實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR）

討 論

抑癌基因 Smad4是轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵分子，TGF-β/Smad4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可通過阻斷細(xì)胞周期的G1/S期轉(zhuǎn)換，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。文獻(xiàn)報(bào)道PanIN和胰腺癌的Smad4基因突變率約為50%，而其他腫瘤中的突變率通常＜10%，提示Smad4基因是PanIN和胰腺癌較特異的抑癌基因[6]。

本課題組的前期研究采用RNA干擾技術(shù)沉默Smad4基因表達(dá)，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)在Kras基因突變啟動(dòng)的PanIN細(xì)胞中沉默Smad4基因可促進(jìn)PanIN細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，但其具體機(jī)制尚未闡明。PanIN-S細(xì)胞增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）陽性表達(dá)率顯著高于PanIN細(xì)胞，提示Smad4基因缺失聯(lián)合Kras基因突變可顯著促進(jìn)PanIN細(xì)胞增殖，且有進(jìn)展為胰腺導(dǎo)管腺癌的可能[6]。

本研究通過基因芯片技術(shù)檢測(cè)PanIN細(xì)胞和PanIN-S細(xì)胞的基因表達(dá)譜差異，結(jié)果示兩組細(xì)胞涉及細(xì)胞周期、增殖、凋亡、黏附、轉(zhuǎn)錄活性等的237個(gè)基因出現(xiàn)差異表達(dá)，其中與細(xì)胞周期相關(guān)的差異表達(dá)基因包括p27、p19、cyclin D1，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR驗(yàn)證結(jié)果與基因芯片篩選結(jié)果一致，由此提示細(xì)胞周期相關(guān)基因p27、p19、cyclin D1表達(dá)異?？赡軈⑴c了PanIN-S細(xì)胞的增殖和惡性轉(zhuǎn)化。

p27基因又稱CDKN1B，其編碼蛋白屬Cip/Kip家族，可與CDK2競(jìng)爭性結(jié)合，致cyclin A-CDK2、cyclin E-CDK2、cyclin B-CDK2等復(fù)合體形成受抑，以阻止細(xì)胞從G2期進(jìn)入M期。Shiraso等[7]的研究證實(shí)p27kip1過表達(dá)可明顯抑制膽管癌細(xì)胞生長。Chen等[8]的大樣本病例對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)，p27基因突變?nèi)巳喊l(fā)生胰腺癌的概率明顯高于普通人群。p19基因又稱CDKN2D，其編碼的CDK抑制蛋白可通過與CDK4或CDK6競(jìng)爭性結(jié)合抑制cyclin D-CDK4或cyclin D-CDK6復(fù)合體形成，從而阻止細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。Ulanet等[9]的研究發(fā)現(xiàn)p19基因缺失可經(jīng)p53依賴和p53非依賴性途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。本研究結(jié)果示PanIN-S細(xì)胞的p27、p19表達(dá)顯著低于PanIN細(xì)胞，提示Smad4基因沉默可抑制p27、p19表達(dá)，推測(cè)前者可能通過促進(jìn)cyclin B-CDK2復(fù)合體形成，使細(xì)胞從G2期進(jìn)入M期；后者可能通過促進(jìn)cyclin D-CDK4復(fù)合體形成，使細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，由此促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。

cyclin D1可促進(jìn)細(xì)胞增殖，作為細(xì)胞周期中短暫出現(xiàn)的基因表達(dá)產(chǎn)物，具有嚴(yán)格的周期順序性，可與特定CDK結(jié)合形成復(fù)合體，以促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，其過表達(dá)可縮短G1期，減少細(xì)胞對(duì)生長因子的依賴，故可導(dǎo)致細(xì)胞持續(xù)分裂和增殖。Halilovic等[10]的研究發(fā)現(xiàn)PIK3CA基因突變可修復(fù)cyclin D1，致腫瘤細(xì)胞持續(xù)增殖。Radulovich等[11]的研究發(fā)現(xiàn)cyclin D3為胰腺癌細(xì)胞周期原始啟動(dòng)子，cyclin D1和cyclin D3可協(xié)同促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的有絲分裂。本研究結(jié)果示PanIN-S細(xì)胞cyclin D1表達(dá)增加，推測(cè)Smad4基因沉默可促進(jìn)cyclin D1表達(dá)，通過與CDK2、CDK4形成復(fù)合體，使細(xì)胞進(jìn)入S期，由此促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。

綜上所述，本研究通過基因芯片技術(shù)篩選并經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)Smad4基因沉默可致PanIN細(xì)胞的細(xì)胞周期相關(guān)基因p27、p19和cyclin D1表達(dá)發(fā)生明顯改變，這可能是其參與PanIN-S細(xì)胞增殖和惡性轉(zhuǎn)化的機(jī)制之一。對(duì)差異表達(dá)基因的深入研究有助于闡明多基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在胰腺癌發(fā)生中的作用，從而為胰腺癌的診斷和治療提供新的線索。

1 王琪,王立夫.小鼠胰腺腫瘤模型的研究進(jìn)展.內(nèi)科理論與實(shí)踐,2010,5(6):507-510.

2 Koorstra JB,Feldmann G,Habbe N,et al.Morphogenesis of pancreatic cancer:role of pancreatic intraepithelial neoplasia (PanINs).Langenbecks Arch Surg,2008,393(4):561-570.

3 Yasutome M,Gunn J,Korc M.Restoration of Smad4 in BxPC3 pancreatic cancer cells attenuates proliferation without altering angiogenesis.Clin Exp Metastasis,2005,22(6):461-473.

4 Hingorani SR,Wang L,Multani AS,et al.Trp53R172H and KrasG12D cooperate to promote chromosomal instability and widely metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma in mice.Cancer Cell,2005,7(5):469-483.

5 王立夫,Tuveson DA.Kras突變小鼠胰腺癌前病變PanIN細(xì)胞的生物學(xué)特性.中國癌癥雜志,2006,16(8):651-657.

6 齊曉光,慎睿哲,王立夫,等.Smad4基因沉默促進(jìn)PanlN裸鼠移植瘤增殖和微血管形成的研究.中國癌癥雜志,2009,19(7):485-490.

7 Shiraso S, Katayose Y, Yamamoto K, et al.Overexpression of adenovirus-mediated p27kip1 lacking the Jab1-binding region enhances cytotoxicity and inhibits xenografted human cholangiocarcinoma growth.Anticancer Res,2009,29(6):2015-2024.

8 Chen J,Amos CI,Merriman KW,et al.Genetic variants of p21 and p27 and pancreatic cancer risk in non-Hispanic Whites:a case-control study.Pancreas,2010,39(1):1-4.

9 Ulanet DB,Hanahan D.Loss of p19(Arf)facilitates the angiogenic switch and tumor initiation in a multi-stage cancermodelvia p53-dependentand independent mechanisms.PLoS One,2010,5(8):e12454.

10 Halilovic E,She QB,Ye Q,et al.PIK3CA mutation uncouples tumor growth and cyclin D1 regulation from MEK/ERK and mutant KRAS signaling.Cancer Res,2010,70(17):6804-6814.

11 Radulovich N,Pham NA,Strumpf D,et al.Differential roles ofcyclin D1 and D3 in pancreatic ductal adenocarcinoma.Mol Cancer,2010,9:24.