孫學成 廖 專 李兆申

第二軍醫(yī)大學長海醫(yī)院消化科1（200433） 溫州醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院消化科2

ghrelin和obestatin是一對來源于同一前體基因preproghrelin的重要肽類激素，經(jīng)不同翻譯后修飾，與不同受體結合，發(fā)揮生理學作用。ghrelin由28個氨基酸組成，能促進生長激素分泌，具有刺激攝食、誘導脂肪合成、增加體質(zhì)量等正向能量代謝調(diào)節(jié)作用；此外，ghrelin還可刺激胃酸分泌和胃動力，抑制膽囊收縮素-8（CCK-8）刺激引起的胰腺外分泌增加[1]。obestatin由23個氨基酸組成，最初研究發(fā)現(xiàn)其具有與ghrelin相拮抗的生理學功能，是一種食欲抑制激素[2]。本實驗建立大鼠胰腺外分泌模型，旨在觀察靜脈注射小劑量obestatin對大鼠胰腺外分泌以及CCK-8刺激引起的胰腺外分泌增加的影響。

材料與方法

一、實驗動物和主要試劑

2～3月齡健康雄性清潔級Sprague-Dawley大鼠24只，體質(zhì)量200～250 g，購自第二軍醫(yī)大學實驗動物中心。實驗前大鼠于同一實驗室條件下飼養(yǎng)1周：恒定溫度和濕度，標準飲食，自由飲水，每天8:00-20:00予日光燈照射模擬晝夜循環(huán)。

大鼠 obestatin （Phoenix Pharmaceuticals,Inc.）使用前以0.9%NaCl配制成1 nmol/ml和5 nmol/ml的溶液，分裝，－20℃保存；大鼠CCK-8（康肽生物科技北京有限公司）使用前以含1%胎牛血清的0.9%NaCl配制成400 pmol/ml的溶液；BCA蛋白測定試劑盒（BCA Protein Assay Kit,Pierce Protein Research Products,Thermo Fisher Scientific Inc.）。

二、方法

24 只大鼠隨機分為三組，分別為 1 nmol·kg-1·h-1obestatin+CCK-8 組（A 組）、5 nmol·kg-1·h-1obestatin+CCK-8（B 組）和 CCK-8組（C 組），每組 8只。 實驗前禁食12 h，自由飲水，所有實驗均于9∶00開始。

于安靜、無菌條件下予大鼠3%戊巴比妥鈉15 mg/300 g腹腔內(nèi)麻醉，分別于右側股靜脈和尾靜脈留置靜脈導管；腹部正中線切口，將Intima-Ⅱ靜脈留置針自十二指腸乳頭對側腸壁經(jīng)十二指腸乳頭開口插入膽胰管，見黃色膽胰混合液（pancreaticbiliary juice,P-BJ）順暢流出后固定；于十二指腸乳頭上方插入Intima-Ⅱ靜脈留置針，用以回輸P-BJ。紅外線烤燈照射使大鼠肛溫維持于37℃左右，穩(wěn)定30 min后開始實驗。每15 min經(jīng)膽胰管插管收集一次P-BJ，以微量進樣器測定體積后留取50μl，雙蒸水稀釋，參照BCA蛋白測定試劑盒說明書測定蛋白含量。由于膽汁中蛋白含量很低，因此P-BJ中蛋白含量的變化可以反映胰液蛋白分泌量，單位時間內(nèi)胰液蛋白分泌量為該時段P-BJ體積與測得的蛋白含量的乘積。其余部分P-BJ于下一收集時段內(nèi)經(jīng)乳頭上方留置導管以2 ml/h的速率回輸至十二指腸內(nèi)。

將第一次收集的P-BJ作為基礎胰腺分泌，然后A、B組大鼠以微量注射泵經(jīng)尾靜脈持續(xù)注射obestatin 直至實驗結束（1 nmol·kg-1·h-1和 5 nmol·kg-1·h-1），收集 2 次 P-BJ后（30 min 后），再經(jīng)股靜脈持續(xù)注射 CCK-8直至實驗結束（400 pmol·kg-1·h-1[1]），收集6次P-BJ。C組大鼠僅經(jīng)股靜脈注射400 pmol·kg-1·h-1CCK-8 作為對照，注射時間同 A、B組。

三、統(tǒng)計學分析

結 果

一、靜脈注射小劑量obestatin對P-BJ體積的影響

大鼠基礎胰腺分泌量為（136±44）μl/15 min。A、B組尾靜脈內(nèi)注射 obestatin 15 min和30 min后，單位時間內(nèi)P-BJ體積與基礎值相比無明顯差異。股靜脈內(nèi)注射CCK-815 min后，三組P-BJ體積均開始升高，于注射后30 min或45 min達高峰，隨后緩慢下降，各時點與基礎值相比差異均有統(tǒng)計學意義。A、B組各時點單位時間內(nèi)P-BJ體積與同時點C組相比，差異均無統(tǒng)計學意義（見圖1）。

圖1 靜脈注射小劑量obestatin對P-BJ體積的影響

二、靜脈注射小劑量obestatin對胰液蛋白分泌的影響

大鼠基礎胰液蛋白分泌量為（11.9±2.2）mg/15 min。A、B組尾靜脈內(nèi)注射obestatin 15 min和30 min后，單位時間內(nèi)胰液蛋白分泌量與基礎值相比無明顯差異。股靜脈內(nèi)注射CCK-815 min后，三組胰液蛋白分泌量均開始升高，于注射后45 min達高峰，隨后緩慢下降，各時點與基礎值相比差異均有統(tǒng)計學意義。A、B組各時點單位時間內(nèi)胰液蛋白分泌量與同時點C組相比，差異均無統(tǒng)計學意義（見圖 2）。

圖2 靜脈注射小劑量obestatin對胰液蛋白分泌的影響

討 論

作為ghrelin的相關肽，obestatin自發(fā)現(xiàn)以來即成為研究熱點，對于其生理學功能存在較多爭議。obestatin的發(fā)現(xiàn)者Zhang等[2]報道，obestatin能抑制攝食和胃腸功能。外源性obestatin腹腔內(nèi)注射能時間和劑量依賴性地抑制小鼠攝食量，腦室內(nèi)注射亦能抑制攝食量；此外，obestatin還能抑制體質(zhì)量增加，持續(xù)抑制胃排空活動，降低空腸肌收縮能力，對體外培養(yǎng)大鼠垂體細胞的生長激素分泌無明顯影響。雖然一些研究小組證實了obestatin對攝食和體質(zhì)量增加的抑制作用[3,4]，但亦有實驗未能觀察到外源性obestatin對攝食和胃腸動力的影響，對ghrelin刺激攝食和胃腸動力的作用亦無拮抗效應[5～7]，或發(fā)現(xiàn)外源性obestatin本身不能調(diào)節(jié)攝食，但能抑制外源性ghrelin的促進食欲和刺激生長激素分泌作用[8]。有研究[8]發(fā)現(xiàn)，雖然ghrelin與obestatin的分泌節(jié)律均呈搏動性，但兩者的血漿水平并不顯著相關，空腹24 h后ghrelin水平顯著升高而obestatin水平僅輕微降低；在某些病理狀態(tài)下如胃旁路術后，兩者水平的變化亦不一致[9]。關于obestatin的爭議還在于其受體。obestatin的發(fā)現(xiàn)者Zhang等[2]報道其受體為G蛋白偶聯(lián)受體GPR39，這一發(fā)現(xiàn)經(jīng)使用GPR39基因敲除小鼠的動物實驗證實[10]。但隨后三項通過基因轉染技術表達GPR39的實驗均未能重復Zhang等[2]的研究結果[5,11,12]，且有研究[11,13]發(fā)現(xiàn)obestatin的可能中樞靶器官垂體和下丘腦中并無GPR39表達。

研究[1]發(fā)現(xiàn)ghrelin雖可抑制CCK-8刺激引起的胰腺外分泌增加，但對基礎胰腺分泌量、基礎胰液蛋白分泌和基礎淀粉酶分泌均無明顯影響。Kapica等[14]則發(fā)現(xiàn)大劑量外源性 obestatin（30、100、300 nmol/kg）可增加麻醉大鼠的胰液蛋白分泌和胰蛋白酶活性。上述研究結果并不符合obestatin與ghrelin作用“對立”的理論。Qader等[15]的研究發(fā)現(xiàn)，ghrelin和obestatin均能抑制胰島細胞分泌對胰腺分泌具有抑制作用的胰多肽和生長抑素。因此關于外源性obestatin對胰腺外分泌的影響，目前仍無定論。本實驗建立大鼠胰腺外分泌模型，對此作了進一步的研究。

根據(jù)Kapica等[14]的研究結果，經(jīng)靜脈給予obestatin 15 min后胰液蛋白分泌即顯著增加，并于30 min時達高峰，加之obestatin的血漿半衰期甚短，僅約22 min，因此本實驗采用持續(xù)靜脈內(nèi)給藥方式，使obestatin起效更快，血藥濃度更穩(wěn)定。由于obestatin在1～5 nmol/kg的劑量范圍內(nèi)即可抑制空腸肌收縮[2]，而大鼠體內(nèi)obestatin的生理濃度遠低于此劑量[16]，因此本實驗obestatin的劑量選用 1 nmol·kg-1·h-1和 5 nmol·kg-1·h-1。De Spiegeleer等[17]的研究表明，造成obestatin功能研究結論分歧的原因為，源自不同廠商的obestatin，純度和質(zhì)量存在差異。本實驗選用Ren等[18]的研究中使用的obestatin，該研究小組關于外源性obestatin對大鼠胰島素分泌影響的研究得出陽性結果。

本實驗結果顯示靜脈注射CCK-8可刺激大鼠的胰液和胰液蛋白分泌，而靜脈注射小劑量（1 nmol·kg-1·h-1和 5 nmol·kg-1·h-1）obestatin 對 胰腺外分泌無明顯影響，亦不能改變由CCK-8刺激引起的胰腺外分泌增加，與本課題組前期體外實驗結果（obestatin不影響胰腺腺泡和胰腺小葉的淀粉酶分泌）一致。胰腺外分泌系由神經(jīng)、體液因素組成的復雜網(wǎng)絡所調(diào)控，而本實驗又存在一定局限性，因此根據(jù)本實驗結果仍無法確定obestatin的藥理學作用。與Kapica等[14]的研究相比，本實驗選用的obestatin劑量較小，因此不能推斷其他劑量對胰腺外分泌無影響。Zhang等[2]研究obestatin對胃腸功能的影響時采用腹腔給藥，而本實驗則采用靜脈給藥，給藥方式亦可能對實驗結果產(chǎn)生影響。而且，目前尚不清楚obestatin是否對胰腺外分泌具有雙向調(diào)節(jié)作用。綜上所述，靜脈注射小劑量obestatin對大鼠胰腺外分泌無明顯影響，且不能改變由CCK-8刺激引起的胰腺外分泌增加。今后尚需擴大obestatin的劑量范圍并采用不同給藥方式，對該結果作進一步論證。

1 ZhangW,Chen M,Chen X,etal.Inhibition of pancreatic protein secretion by ghrelin in the rat.J Physiol,2001,537(Pt 1):231-236.

2 Zhang JV,Ren PG,Avsian-KretchmerO,etal.Obestatin,a peptide encoded by the ghrelin gene,opposes ghrelin’s effects on food intake.Science,2005,310(5750):996-999.

3 Lagaud GJ,Young A,Acena A,et al.Obestatin reduces food intake and suppresses body weight gain in rodents.Biochem Biophys Res Commun,2007,357(1):264-269.

4 Green BD,Irwin N,Flatt PR.Direct and indirect effects of obestatin peptides on food intake and the regulation of glucose homeostasisand insulin secretion in mice.Peptides,2007,28(5):981-987.

5 Tremblay F,Perreault M,Klaman LD,et al.Normal food intake and body weight in mice lacking the G proteincoupled receptor GPR39.Endocrinology,2007,148(2):501-506.

6 Seoane LM,Al-Massadi O,Pazos Y,et al.Central obestatin administration does not modify either spontaneous or ghrelin-induced food intake in rats.J Endocrinol Invest,2006,29(8):RC13-RC15.

7 Bassil AK,H?glund Y,Brown J,et al.Little or no ability of obestatin to interact with ghrelin or modify motility in the rat gastrointestinal tract.Br J Pharmacol,2007,150(1):58-64.

8 Zizzari P,Longchamps R,Epelbaum J,et al.Obestatin partially affects ghrelin stimulation of food intake and growth hormone secretion in rodents.Endocrinology,2007,148(4):1648-1653.

9 Stenstr?m B,Furnes MW,T?mmer?s K,et al.Mechanism of gastric bypass-induced body weight loss:one-year follow-up after micro-gastric bypass in rats.J Gastrointest Surg,2006,10(10):1384-1391.

10 Moechars D,Depoortere I,Moreaux B,et al.Altered gastrointestinal and metabolic function in the GPR39-obestatin receptor-knockoutmouse.Gastroenterology,2006,131(4):1131-1141.

11 Holst B,Egerod KL,Schild E,et al.GPR39 signaling is stimulated by zinc ions but not by obestatin.Endocrinology,2007,148(1):13-20.

12 Lauwers E,Landuyt B,Arckens L,et al.Obestatin does not activate orphan G protein-coupled receptor GPR39.Biochem Biophys Res Commun,2006,351(1):21-25.

13 Jackson VR,Nothacker HP,Civelli O.GPR39 receptor expression in the mouse brain.Neuroreport,2006,17(8):813-816.

14 Kapica M,Zabielska M,Puzio I,et al.Obestatin stimulates the secretion of pancreatic juice enzymes through a vagalpathway in anaesthetized rats -preliminary results.J Physiol Pharmacol,2007,58 Suppl 3:123-130.

15 Qader SS,H?kanson R,Rehfeld JF,et al.Proghrelinderived peptides influencethesecretion ofinsulin,glucagon,pancreatic polypeptide and somatostatin:a study on isolated islets from mouse and rat pancreas.Regul Pept,2008,146(1-3):230-237.

16 Mondal MS,Toshinai K,Ueno H,et al.Characterization of obestatin in rat and human stomach and plasma,and its lack of acute effect on feeding behavior in rodents.J Endocrinol,2008,198(2):339-346.

17 De Spiegeleer B,Vergote V,Pezeshki A,et al.Impurity profiling quality control testing of synthetic peptides using liquid chromatography-photodiode arrayfluorescence and liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry:the obestatin case.Anal Biochem,2008,376(2):229-234.

18 Ren AJ,Guo ZF,Wang YK,et al.Inhibitory effect of obestatin on glucose-induced insulin secretion in rats.Biochem Biophys Res Commun,2008,369(3):969-972.