沈 雁呂 賓# 張 爍馬忠俊

浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科1（310006） 浙江大學(xué)藥學(xué)院現(xiàn)代中藥研究所2

結(jié)腸癌是臨床上常見的消化系惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率在所有癌癥中均位居前列，5年生存率低，且治療費(fèi)用高昂[1,2]。Fearon等[3]提出了結(jié)腸癌的多步驟發(fā)生理論，即正常黏膜→增生黏膜→腺瘤→原位癌→浸潤癌的發(fā)生途徑。推測該過程或許與體內(nèi)結(jié)腸腺上皮細(xì)胞表型惡性轉(zhuǎn)化、增殖與凋亡行為失衡有關(guān)。

溫郁金是姜科姜黃屬植物溫郁金（Curcuma wenyujinY.H.Chen et C.Ling）的干燥塊根，其藥性寒，味辛、苦，歸心、肝、膽經(jīng)，具有活血止痛、行氣解郁、清心涼血、利膽退黃等功效[4]。從傳統(tǒng)中藥中提取活性成分為開發(fā)新型抗腫瘤藥物開辟了廣闊的道路。研究[5]發(fā)現(xiàn)，溫郁金提取物在體外能明顯抑制胃癌的發(fā)生和發(fā)展。二萜類化合物C為溫郁金醚提物中的活性單體。本實驗通過觀察二萜類化合物C對結(jié)腸腺癌SW620細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響，旨在探討其抗腫瘤作用的分子機(jī)制，從而為結(jié)腸癌的藥物研發(fā)以及臨床治療提供新選擇。

材料與方法

一、藥物制備、細(xì)胞株、主要試劑和儀器

溫郁金干燥根莖 10 kg，以 8倍量（80 L）95%乙醇回流提取4次，回收溶劑得粗提物247 g?？偨嘁?00 ml水分散均勻，依次用1倍量（500 ml）石油醚、二氯甲烷、正丁醇萃取，得二氯甲烷萃取物95.1 g。二氯甲烷部分以石油醚/乙酸乙酯為洗脫劑，硅膠柱層析得10個流分A～J。流分E以乙腈（70%）-水（30%）為流動相，制備色譜進(jìn)一步分離得8個流分（0～80 min，每 10 min 1個流分），即 E1～E8。 其中 E8 以乙腈（45%）-水（55%）等度洗脫，二次制備得二萜類化合物 C（5.0 mg，tR 43.7 min），分子質(zhì)量為380，分子式為C22H36O5[6]。

人結(jié)腸腺癌細(xì)胞株SW620購自中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞庫。Leibovitz’s L-15培養(yǎng)基、0.25%胰酶（杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司）、胎牛血清（Gibco公司）、MTT 干粉（Ameresco公司）、Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒（Biouniquer公司）、PI 染液（Sigma 公司）、5-氟尿嘧啶（5-Fu）注射液（天津金耀氨基酸有限公司，分子質(zhì)量130.08）。

倒置相差顯微鏡（Olympus公司），CO2培養(yǎng)箱、離心機(jī)（Thermo），酶標(biāo)儀（BioTek），流式細(xì)胞儀（BD公司）。

二、方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)：將SW620細(xì)胞加入含10%胎牛血清的L-15培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

2.MTT法檢測細(xì)胞增殖情況：取對數(shù)生長期細(xì)胞，用含10%胎牛血清的L-15培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為 5×104/ml，接種于 96 孔培養(yǎng)板，每孔 200μl，培養(yǎng)24 h后吸棄上清液。實驗組每孔加入含二萜類化合物C的L-15培養(yǎng)基200μl，使其終濃度分別為10～70μg/ml，共7組；陰性對照組每孔加入200μl培養(yǎng)基；空白對照組加不含細(xì)胞的血清培養(yǎng)基；陽性對照組每孔加入含5-Fu的培養(yǎng)基200μl，使其終濃度同二萜類化合物C；每個劑量設(shè)3個復(fù)孔。培養(yǎng)24、48和72 h后，每孔加5 mg/ml MTT溶液20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后用快速翻板法棄上清；每孔加 DMSO 150μl，振蕩 10 min，上酶標(biāo)儀測定吸光度（A）值，檢測波長為490 nm。計算細(xì)胞生長抑制率，抑制率（%）=[（陰性對照組A值-空白對照組A值）-（實驗對照組A值-空白對照組A值）]/（陰性對照組A值-空白對照組A值）×100%。

3.倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化：取對數(shù)生長期細(xì)胞，用含10%胎牛血清的L-15培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105/ml，取3 ml加入中號培養(yǎng)皿，培養(yǎng)24 h后吸棄上清液；將含二萜類化合物C的培養(yǎng)基3 ml加入培養(yǎng)皿中，使其終濃度分別為40、55、70μg/ml。 同時以加入等體積培養(yǎng)基的細(xì)胞作為陰性對照組，每組重復(fù)3次。倒置相差顯微鏡下觀察48 h后細(xì)胞生長狀態(tài)。

4.細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期變化的檢測：取對數(shù)生長期細(xì)胞，用含10%胎牛血清的L-15培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105/ml，取3 ml加入中號培養(yǎng)皿，培養(yǎng)24 h后吸棄上清液；將含二萜類化合物C的培養(yǎng)基3 ml加入培養(yǎng)皿中，使其終濃度分別為40、55、70μg/ml。同時以加入等體積培養(yǎng)基的細(xì)胞作為陰性對照組。分別培養(yǎng)24 h、48 h后，以不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，PBS漂洗2次，2000 r/min離心5 min。先加入500μl Binding Buffer懸浮細(xì)胞后，再加入5μl Annexin V-FITC混勻，室溫避光反應(yīng)5～15 min后，上機(jī)檢測細(xì)胞凋亡率；加入70%冷乙醇，4℃固定12 h，再加入1 ml PI染液，室溫避光孵育20 min后，上機(jī)檢測細(xì)胞周期。激發(fā)波長為488 nm，并用相應(yīng)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、MTT測定結(jié)果

不同濃度的二萜類化合物C和5-Fu對SW620細(xì)胞增殖均有不同程度的抑制作用，其中60μg/ml二萜類化合物C作用72 h時的細(xì)胞抑制率最高，達(dá)95.30%±1.48%。同一時間點二萜類化合物C的抑制能力隨其濃度的增加而升高（P<0.05）；除70μg/ml組作用48 h和72 h時的抑制率無明顯差異外，其余同一濃度二萜類化合物C的抑制能力隨其作用時間的延長而升高（P<0.05）。作用24 h、48 h和72 h時，二萜類化合物C對SW620細(xì)胞的半數(shù)有效抑制濃度分別為 28.31、15.58 和 6.14μg/ml。 此外，二萜類化合物C的抑制能力均顯著高于相同時間點和濃度的 5-Fu（P<0.01）（見圖1）。

二、倒置相差顯微鏡結(jié)果

不同濃度二萜類化合物C均能誘導(dǎo)SW620細(xì)胞凋亡，呈現(xiàn)出特征性形態(tài)改變，如胞膜皺縮、細(xì)胞逐漸變圓、體積縮小、細(xì)胞間隙增寬、細(xì)胞從基質(zhì)上脫離等；且這種改變與藥物濃度呈正相關(guān)，70μg/ml組多數(shù)SW620細(xì)胞處于晚期凋亡階段，培養(yǎng)基中可見較多的細(xì)胞碎片漂浮。而陰性對照組SW620細(xì)胞呈梭形、簇狀生長，并隨著時間的延長，細(xì)胞數(shù)目增多、密度增高（見圖2）。

三、細(xì)胞凋亡結(jié)果

不同濃度二萜類化合物C均能誘導(dǎo)活性SW620細(xì)胞進(jìn)入早期和（或）晚期凋亡階段。同一時間點其促凋亡能力隨濃度的增加而升高（P<0.01），且同一濃度二萜類化合物C作用48 h時的SW620細(xì)胞凋亡率（包括早期和晚期）顯著高于24 h組（P<0.01）。 70μg/ml二萜類化合物 C 作用 48 h 時的凋亡率最高，達(dá)84.97%±0.58%（見圖3）。

圖1 不同濃度二萜類化合物C和5-Fu作用24、48和72 h時對SW620細(xì)胞增殖的抑制率

圖2 二萜類化合物C作用48 h時SW620細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特點

圖3 不同濃度不同時間點二萜類化合物C誘導(dǎo)SW620細(xì)胞凋亡的比較

作用24或48 h后，各濃度二萜類化合物C組的G2期比例較陰性對照組明顯減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；作用48 h后，同一濃度二萜類化合物C的G2期比例較24 h組減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。此外，二萜類化合物C作用48 h后，55、70μg/ml組 SW620 細(xì)胞周期于 G0/G1期前可見明顯的亞二倍體峰（凋亡峰）（見圖4）。

討 論

腫瘤的發(fā)生是人類正常細(xì)胞增殖與凋亡之間平衡失調(diào)導(dǎo)致表型惡性轉(zhuǎn)化的結(jié)果：周圍環(huán)境中各種促癌信號的過度刺激引起細(xì)胞內(nèi)外有序的信號傳遞網(wǎng)絡(luò)發(fā)生異常，進(jìn)而導(dǎo)致下游各種基因突變并逐漸累積，最終促使細(xì)胞由正常表型發(fā)展成為增殖失控、凋亡失能的癌性表型。因此，通過阻滯細(xì)胞周期以抑制增殖過程的啟動或促進(jìn)細(xì)胞凋亡，均能起到較好的抗癌作用。

溫郁金是臨床上常用的中藥，其抗腫瘤作用正日益受到關(guān)注。本課題的前期研究[5]結(jié)果顯示，溫郁金的水提物、醚提物和醇提物在體外均能抑制人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖，且后兩者尚具有良好的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)，其作用機(jī)制可能與下調(diào)血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）、環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2,COX-2）水平以減少瘤灶內(nèi)微血管密度（microvessel density,MVD）[7]、提高血漿和組織中生長抑素表達(dá)[8]、抑制胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor,IGF）Ⅰ和Ⅱ的分泌[9]等有關(guān)。近來對溫郁金抗癌成分的研究主要集中于姜黃素和欖香烯，而其他活性成分的相關(guān)研究較少。國內(nèi)外大量研究發(fā)現(xiàn)，溫郁金醇提物的主要成分姜黃素可分別以腫瘤細(xì)胞本身[10]、腫瘤相關(guān)蛋白[11,12]、相關(guān)基因[13]、相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[14,15]為靶標(biāo)發(fā)揮高效的抗癌活性；溫郁金醚提物的主要成分欖香烯能通過下調(diào)Bcl-2表達(dá)[16,17]、抑制端粒酶活性[17]、阻斷細(xì)胞周期[18]等方式誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，具有多效性。

在此基礎(chǔ)上，本研究從溫郁金醚提物中提取了一種新型二萜類化合物C，其化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)均有別于姜黃素和欖香烯[6]。同時，選擇臨床上結(jié)直腸癌的主要化療藥物5-Fu作為陽性對照，其能通過在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為5-氟尿嘧啶脫氧核苷酸（5F-dUMP）而抑制脫氧胸苷酸合成酶，影響DNA的生物合成，抑制腫瘤細(xì)胞的分裂增殖。本研究結(jié)果顯示二萜類化合物C對SW620細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用，并呈時間依賴性和濃度依賴性，且二萜類化合物C的抑制作用明顯強(qiáng)于相同時間點和濃度的5-Fu。倒置相差顯微鏡可見二萜類化合物C能引起SW620細(xì)胞發(fā)生典型的凋亡改變，如細(xì)胞皺縮、變圓、體積縮小、脫離基質(zhì)等。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果提示，二萜類化合物C能隨著作用時間的延長和濃度的增高而使處于G2期細(xì)胞的比例明顯減少，并顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

圖4 不同濃度不同時間點二萜類化合物C對SW620細(xì)胞周期分布的影響

綜上所述，溫郁金醚提物中二萜類化合物C對人結(jié)腸腺癌SW620細(xì)胞具有高效的抑制增殖和促進(jìn)凋亡的作用，可能是其發(fā)揮抗腫瘤作用的機(jī)制之一。但鑒于人類生命活動調(diào)控的復(fù)雜性，二萜類化合物C的抗癌效應(yīng)或許存在更多潛在機(jī)制，有待進(jìn)一步探討。更為深入的研究將為溫郁金抗腫瘤成分的開發(fā)及其臨床應(yīng)用產(chǎn)生巨大的推動作用，為結(jié)腸癌的藥物治療開拓全新的思路。

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