陳新梅

(山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355)

鼻腔給藥作為一種新的給藥途徑日益受到人們的關(guān)注，鼻腔給藥對蛋白質(zhì)、多肽類藥物、基因藥物、口服難吸收藥物及口服有首過效應(yīng)的藥物是一種有前景的給藥途徑［1］。由于鼻腔纖毛的清除功能，藥液在鼻腔的滯留時(shí)間僅15～30min，粉末和顆粒在鼻腔的總接觸時(shí)間是20～30min，在一定程度上影響了藥物的吸收和療效。為降低鼻腔清除率，延長藥物滯留時(shí)間來增加吸收量，常加入生物黏附劑［2］，如CMC－Na、HPMC、明膠、淀粉、殼聚糖等，其中殼聚糖［3］以生物相容性好、毒性低、可控制藥物的釋放、改善易降解物質(zhì)的生物利用度、增強(qiáng)親水性藥物通過上皮層的滲透性等優(yōu)勢在藥劑學(xué)中得到廣泛應(yīng)用［3］。殼聚糖的脫乙酰度，即殼聚糖分子中脫除乙酰基的糖殘基數(shù)占?xì)ぞ厶欠肿又锌偟奶菤埢鶖?shù)的百分?jǐn)?shù)，是評價(jià)殼聚糖質(zhì)量的一個(gè)重要指標(biāo)，直接關(guān)系到殼聚糖在稀酸中的溶解能力、富集離子的能力、離子交換能力等。本試驗(yàn)考察了不同脫乙酰度的殼聚糖的鼻腔毒性。

1 儀器與材料

1.1 儀器 AO(雙目)光學(xué)顯微鏡(American Optical公司);ASP300型自動(dòng)脫水機(jī)(LEICA公司);EG1160型包埋機(jī)(LEICA公司);RM2135型切片機(jī)(LEICA公司);鼻腔給藥噴霧瓶(蘇州萬通定量閥公司)。

1.2 藥品與試劑 殼聚糖(山東奧康生物科技有限公司，脫乙酰度分別為 82.8%、85.4%、88.5%、91.1%、92.1%、95.4%);去氧膽酸鈉(生化純，上海伯奧生物科技有限公司，批號:030208)。其余試劑均為分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年SD大鼠，雌性，體重(250±50)g;蟾蜍45～85 g，雌雄兼用。所有動(dòng)物均由山東中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物證號:SYXK(魯)20050043。

2 方法

2.1 在體蟾蜍上腭法研究殼聚糖對纖毛運(yùn)動(dòng)的影響 將蟾蜍仰臥固定，用止血鉗牽拉，使口腔張開，于上腭粘膜處滴加藥液0.5mL，使藥液完全浸沒上腭，接觸30min后，用生理鹽水洗凈藥物，分離蟾蜍兩眼之間的粘膜，面積為3mm×3mm，用生理鹽水洗凈血塊及雜物，粘膜面向上，平鋪于載玻片上，于粘膜表面滴加生理鹽水0.2mL，蓋上蓋玻片，于10×45倍光學(xué)顯微鏡下觀察纖毛運(yùn)動(dòng)情況，隨后置于加有少量蒸餾水的密閉容器中，密閉，使水蒸氣近飽和狀態(tài)，環(huán)境溫度保持在20～25℃。每隔適當(dāng)時(shí)間取出，顯微鏡觀察，直到纖毛停止運(yùn)動(dòng)。記錄從開始給藥到纖毛完全停止運(yùn)動(dòng)所需要的時(shí)間。另取蟾蜍如上操作，滴加生理鹽水(Physiological saline)0.5mL作為陰性對照。以公認(rèn)的具有纖毛毒性的1%去氧膽酸鈉(Sodium deoxycholate)作為陽性對照，考察6種不同脫乙酰度的殼聚糖溶液(Chitosan solution)的鼻腔毒性。以給藥組蟾蜍的纖毛持續(xù)運(yùn)動(dòng)時(shí)間除以生理鹽水組蟾蜍的纖毛持續(xù)運(yùn)動(dòng)時(shí)間，得到纖毛持續(xù)運(yùn)動(dòng)時(shí)間相對百分率。相對百分率越高，藥物的纖毛毒性越小。

2.2 殼聚糖對大鼠鼻腔粘膜形態(tài)學(xué)的影響 健康SD大鼠，雌性，分為9組，每組3只。大鼠用乙醚輕微麻醉后，分別鼻腔給予生理鹽水、1%去氧膽酸鈉、6種不同脫乙酰度的0.25%殼聚糖溶液、1%冰醋酸。每100g體重給予0.1mL，每日3次，連續(xù)7 d，第8天股動(dòng)脈放血處死大鼠，立即取鼻中隔粘膜，用定量生理鹽水沖洗。取下粘膜置中性甲醛液中，固定，經(jīng)脫水處理后，石蠟包埋，切片3～5μm，蘇木精－伊紅染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察鼻粘膜組織結(jié)構(gòu)的改變。

3 結(jié)果

3.1 殼聚糖對蟾蜍上腭纖毛運(yùn)動(dòng)時(shí)間的影響［4］殼聚糖對纖毛運(yùn)動(dòng)時(shí)間的影響見表1。作為陽性對照的1%去氧膽酸鈉在30min內(nèi)使纖毛運(yùn)動(dòng)停止。各種脫乙酰度的殼聚糖對纖毛的擺動(dòng)時(shí)間影響不同。2、3、4、6號基本無影響，1號和5號未發(fā)現(xiàn)纖毛運(yùn)動(dòng)，估計(jì)原因?yàn)轶蛤芊胖脮r(shí)間過久(由大鼠鼻腔切片可進(jìn)一步證明所有殼聚糖都無毒性)。由表1可以得出結(jié)論:0.25%殼聚糖溶液對纖毛擺動(dòng)時(shí)間基本沒有影響。

表1 殼聚糖對在體蟾蜍纖毛運(yùn)動(dòng)時(shí)間的影響

蟾蜍上腭粘膜給0.25%殼聚糖溶液后顯微鏡下觀察的結(jié)果見圖1。在顯微鏡下，可直觀的觀察到蟾蜍上腭黏膜纖毛的擺動(dòng)，尤其在黏膜的邊緣更加清晰，如圖1箭頭所示。

圖1 蟾蜍上腭粘膜給0.25%殼聚糖后顯微鏡下結(jié)果(×400)

3.2 殼聚糖對大鼠鼻腔粘膜形態(tài)學(xué)的影響［5］根據(jù)藥物對鼻腔粘膜的刺激作用，將藥物對鼻腔粘膜的刺激作用分為3個(gè)級別:輕度、中度和重度。評判標(biāo)準(zhǔn)如下:

輕度:粘膜上皮細(xì)胞完整，粘膜下少量炎細(xì)胞浸潤。

中度:粘膜上皮細(xì)胞水腫，粘膜下炎細(xì)胞浸潤。

重度:粘膜上皮細(xì)胞變性壞死，大量炎細(xì)胞浸潤。

經(jīng)本次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，去氧膽酸鈉組為重度刺激，生理鹽水組、1%冰醋酸組、6種脫乙酰度的0.25%殼聚糖組為輕度刺激。說明0.25%殼聚糖對大鼠鼻腔粘膜無黏膜毒性，結(jié)果見圖2。

圖2 大鼠鼻粘膜切片圖(×100)

4 討論

研究藥物鼻腔纖毛毒性的動(dòng)物模型有雞胚氣管的粘膜纖毛和蟾蜍上腭粘膜纖毛，后者與哺乳動(dòng)物鼻粘膜纖毛在組織上相似，且材料易得，操作簡便，故應(yīng)用較廣。本次實(shí)驗(yàn)以在體蟾蜍上腭為模型，觀察了殼聚糖對纖毛運(yùn)動(dòng)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明:脫乙酰度為 82.8%、85.4%、88.5%、91.1%、92.1%、95.4%的0.25%殼聚糖溶液對纖毛毒性很小或可看做無纖毛毒性。此外，蟾蜍體重大小、給藥量的多少、所取粘膜的位置及標(biāo)本制作時(shí)間是影響在體蟾蜍上腭模型法測定結(jié)果準(zhǔn)確性及重復(fù)性的主要因素。如本次實(shí)驗(yàn)由于動(dòng)物房提供蟾蜍不是很方便，一次買來的10只蟾蜍在每天做2只的情況下最后2只纖毛未發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)，估計(jì)原因是在不適合蟾蜍生存的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境放置過久。另外在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，即使在飽和水蒸氣的密閉容器中放置切片，仍需要不定時(shí)的在蓋玻片邊緣滴加少量生理鹽水，因?yàn)榍衅?jīng)常的取出在顯微鏡下觀看，觀看時(shí)水分的蒸發(fā)會導(dǎo)致切片失去水分，因失水導(dǎo)致纖毛提前停止運(yùn)動(dòng)會影響最后的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。在裝片前應(yīng)將蟾蜍上腭表皮外的一層粘稠物質(zhì)除去，裝片應(yīng)使粘膜外層朝上，否則不易觀察。

鼻粘膜毒性最直觀的評價(jià)方法是用顯微鏡觀察給藥后粘膜細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)的變化及表面纖毛的形態(tài)變化。殼聚糖對大鼠鼻腔粘膜形態(tài)學(xué)影響的實(shí)驗(yàn)證明:脫乙酰度為82.8%、85.4%、88.5%、91.1%、92.1%、95.4% 的 0.25% 殼聚糖對大鼠鼻粘膜無毒性。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明:不同脫乙酰度的殼聚糖溶液均無鼻腔毒性，因此殼聚糖可作為鼻腔給藥的輔料，在鼻腔給藥系統(tǒng)中廣泛應(yīng)用。

［1］陳新梅.用于全身治療的鼻腔給藥系統(tǒng)研究概況［J］.中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2007，24(1):23 －27.

［2］陳新梅.生物粘附性粉末在鼻腔給藥中的應(yīng)用新進(jìn)展［J］.中國藥業(yè)，2009，18(17):76 －77.

［3］陳新梅，李心沁.殼聚糖載體對藥物鼻腔吸收的促進(jìn)作用［J］.中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2008，13(9):981－984.

［4］王優(yōu)，高永良.G－2407－3鼻腔噴霧劑及其輔料對鼻黏膜纖毛運(yùn)動(dòng)的影響［J］.解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2010，26(1):7－9.

［5］楊艷偉，林志，李珊珊，等.大、小鼠鼻腔毒性病理檢查標(biāo)本制片方法的探討［J］，中國新藥雜志，2009，18(7):646－648.