馬 偉 馬青龍 魏 麗 華君瑞 何進鵬 王菊芳

1（中國科學院近代物理研究所 甘肅省空間輻射生物學重點實驗室 蘭州730000）

2（中國科學院大學 北京100049）

3（蘭州大學基礎醫(yī)學院 蘭州730000）

4（甘肅省人民醫(yī)院檢驗科 蘭州730000）

初級纖毛（Primary cilia）是一種源于基體（母中心粒特化結(jié)構）、以微管為基礎的突出于細胞膜表面的“毛狀”細胞器，存在于絕大多數(shù)哺乳動物細胞中。初級纖毛是細胞感知胞外物理、化學和生物信號的關鍵細胞器，介導多種信號通路的激活和轉(zhuǎn)導［1-2］，其發(fā)生過程受嚴密的細胞周期調(diào)控［3］。早期研究發(fā)現(xiàn)，在多種類型腫瘤細胞及實體瘤組織中均有初級纖毛缺失現(xiàn)象，推測初級纖毛缺失與腫瘤細胞周期失控相關［4-6］。然而，近期研究不但報道宮頸癌及胃腸道間質(zhì)瘤等腫瘤細胞具有初級纖毛［7-8］，而且發(fā)現(xiàn)初級纖毛與腫瘤化療抵抗密切相關［9］，提示初級纖毛可能在調(diào)控腫瘤細胞的應激響應進程中發(fā)揮重要作用。

電離輻射（Ionizing radiation，IR）會引起DNA 損傷，導致染色體畸變和中心粒過度復制等基因組不穩(wěn)定現(xiàn)象［10］。目前，有報道證實紫外線和γ射線照射會促進人成肌細胞、上皮細胞等正常細胞的初級纖毛發(fā)生率升高［11-13］。然而，電離輻射是否影響腫瘤細胞初級纖毛的發(fā)生和生長，及初級纖毛是否影響腫瘤細胞對電離輻射的應激響應仍未見報道。人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系（M059K 和M059J）來源于同一神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者，然而這兩種細胞對DNA 損傷的敏感性存在較大差異，相關的分子機制仍未完全闡明。本研究以M059K 和M059J為研究對象，采用X射線和碳離子束進行照射處理，通過免疫熒光、RNA 干擾及細胞克隆等方法研究電離輻射對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞初級纖毛發(fā)生及初級纖毛對細胞電離輻射敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系M059K 和M059J 購自美國模式培養(yǎng)物集存庫（American type culture collection，ATCC）；DMEM/F-12 培養(yǎng)基購自美國GIBICO公司；胎牛血清購自以色列BI公司；青霉素及硫酸鏈霉素購自美國Sigma 公司。Arl13b（ADP ribosylation factor-like 13b）一抗購自美國Proteintech公司，γ-Tubulin（γ-Tub）一抗購自美國Sigma 公司，熒光二抗（Alexa Fluor 594 和Alexa Fluor 488）購自美國ThermoFisher 公司，IFT88 基因 siRNA （siIFT88， 序 列 為 ： 5′-GAAGAAAGCUGUAUUGCCAAUAGUU-3′ ， 3′-AACUAUUGGCAAUACAGCUUUCUUC-5′ ） 、siRNA 陰性對照（Negative control，NC）及轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

M059K和M059J細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/mL 青 霉 素 和100 μg/mL 硫 酸 鏈 霉 素 的DMEM/F-12完全培養(yǎng)基中，并于5%CO2、飽和濕度的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 細胞照射

細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期后進行照射處理。X射線由PXI Precision X-RAY225照射系統(tǒng)產(chǎn)生，電壓為225 kV，電流為13.3 mA，劑量率為2 Gy/min；碳離子束由中國科學院蘭州重離子加速器（Heavy ion research facility in Lanzhou，HIRFL）淺層治療終端提供，能量為80 MeV/u，傳能線密度（Linear energy transfer，LET）為30 keV/μm，劑量率為2 Gy/min。

1.4 初級纖毛免疫熒光檢測

通過對Arl13b和γ-Tub進行免疫熒光染色指征初級纖毛和基體。其中，Arl13b 屬于小GTP 酶家族，特異定位在初級纖毛膜上［14］；γ-Tub是中心粒結(jié)構蛋白［15］。細胞經(jīng)不同劑量的X 射線或碳離子束照射處理并繼續(xù)培養(yǎng)24～72 h，利用4%多聚甲醛室溫固定10 min后，使用含0.5%Triton X-100的磷酸鹽緩沖液（PBS）透膜5 min，然后用含5%山羊血清的PBS 室溫封閉2 h，之后用Arl13b（1∶500）和γ-Tub（1∶500）一抗孵育2 h，熒光二抗（1∶500）室溫避光孵育2 h，使用含0.5%Tween-20 的PBS 洗 片 并 使 用DAPI（4'，6-diamidino-2-phenylindole）封片。熒光顯微鏡采集圖片并進行統(tǒng)計分析，隨機統(tǒng)計15 個以上視野（不少于500個細胞）。利用ImageJ 軟件測量100 個以上初級纖毛長度并計算平均長度。

1.5 初級纖毛干擾

利用siRNA敲低纖毛轉(zhuǎn)運蛋白IFT88的表達抑制初級纖毛發(fā)生。將siIFT88 與Lipofectamine 2000共轉(zhuǎn)染細胞，5 h后更換新鮮培養(yǎng)基并繼續(xù)培養(yǎng)24 h，固定細胞進行免疫熒光染色，觀察和統(tǒng)計初級纖毛發(fā)生率及長度，以判斷初級纖毛抑制效率。

1.6 細胞克隆形成

以照射至吸收劑量2 Gy 時細胞的相對存活率（Survival fraction at 2 Gy，SF2，以變量fS2表示）征細胞的輻射敏感性。細胞轉(zhuǎn)染siIFT88 或陰性對照NC后分別進行X射線或碳離子束照射至吸收劑量2 Gy。消化細胞，取適量細胞（X射線組為1 000個，碳離子組為2 000個）接種于60 mm的培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 d，75%乙醇固定5 min后用0.5%結(jié)晶紫染液染色3 min，大于50 個細胞的集落視為有效克隆。

克隆形成率=有效克隆數(shù)/接種細胞數(shù)×100%。

fS2=照射后形成的克隆數(shù)/（照射前種植細胞數(shù)×未照射細胞的克隆形成率）。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞初級纖毛檢測

利用免疫熒光技術標記Arl13b和γ-Tub指征初級纖毛的位置和形態(tài)，檢測了人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞M059K 和M059J 初級纖毛表達情況。結(jié)果顯示：M059K和M059J均具有初級纖毛（圖1（a）），但兩種細胞的初級纖毛發(fā)生率明顯不同，M059K 初級纖毛發(fā)生率為(41.36±4.75)%，而M059J 僅為(8.07±1.58)%（圖1（b））。此外，兩種細胞初級纖毛平均長度都超過3 μm，而M059K的初級纖毛平均長度要高于M059J（圖1（c））。以上結(jié)果表明神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞具有初級纖毛結(jié)構，但初級纖毛的發(fā)生率和平均長度在不同細胞間存在差別。

圖1 神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞M059K和M059J初級纖毛發(fā)生率和長度檢測：（a）M059K和M059J初級纖毛免疫熒光圖像（白色箭頭指示初級纖毛，Arl13b（紅色）表示初級纖毛，γ-Tub（綠色）表示基體，DAPI（藍色）表示細胞核，彩色見電子版）；（b）M059K和M059J細胞初級纖毛發(fā)生率；（c）M059K和M059J初級纖毛平均長度；**p＜0.01，M059J vs.M059KFig.1 Detection of the primary cilia incidence and length in glioblastoma M059K and M059J cells:(a)representative immunofluorescence images of the primary cilia in M059K and M059J(white arrows indicate primary cilia,primary cilia were stained for Arl13b(red)and γ-Tub(green),and the nuclei were stained with DAPI(blue),color online);(b)quantification of the ciliated cells in M059K and M059J;(c)quantification of primary cilia length in M059K and M059J;**p＜0.01,M059J vs.M059K

2.2 初級纖毛發(fā)生率與細胞輻射敏感性的相關性

近期研究發(fā)現(xiàn)［9］，化療藥物耐受的肺癌細胞株初級纖毛發(fā)生率顯著升高，表明初級纖毛參與調(diào)控細胞的DNA 損傷應激響應進程，推測初級纖毛與細胞的電離輻射應激響應及輻射敏感性相關。利用X 射線和碳離子束分別對M059K 和M059J 細胞進行不同劑量照射并檢測細胞相對存活率（圖2）。

圖2 初級纖毛發(fā)生率影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞輻射敏感性：（a）不同劑量X射線照射下M059K和M059J的細胞存活率；（b）不同劑量碳離子束照射下M059K和M059J的細胞存活率；*p＜0.05,**p＜0.01,and***p＜0.001,M059J vs.M059KFig.2 Incidence of primary cilia affects the cellular sensitivity to IR in glioblastoma:(a)cellular survival fraction of M059K and M059J cells exposed to X-ray irradiation at different doses;(b)cellular survival fraction of M059K and M059J cells exposed to carbon ion irradiation at different doses;*p＜0.05,**p＜0.01,and***p＜0.001,M059J vs.M059K

結(jié)果顯示，經(jīng)X 射線或碳離子束照射后，M059K 和M059J 細胞的相對存活率均隨吸收劑量增大而顯著降低，并且碳離子束對細胞的殺傷效果更為顯著，而相同吸收劑量處理時，M059K 的相對存活率均明顯高于M059J，表明初級纖毛發(fā)生率低的M059J 細胞較初級纖毛發(fā)生率高的M059K細胞對電離輻射（X射線和碳離子束）更敏感。結(jié)合M059K 和M059J 細胞初級纖毛發(fā)生率的不同（圖1），以上結(jié)果提示神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞初級纖毛發(fā)生率與細胞電離輻射敏感性之間可能存在負相關性。

2.3 X射線影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞初級纖毛發(fā)生

電離輻射能夠促進正常細胞初級纖毛的發(fā)生［12-13］，但電離輻射是否影響腫瘤細胞初級纖毛的發(fā)生和功能仍不清楚。對M059K 和M059J 細胞進行不同劑量X 射線照射處理，并在照射后24 h利用免疫熒光法檢測Arl13b和γ-Tub的表達，結(jié)果顯示X 射線照射同樣具有誘導M059K 細胞初級纖毛發(fā)生的作用，且初級纖毛發(fā)生率隨著吸收劑量的增加逐漸提高，當劑量為10 Gy時，初級纖毛發(fā)生率已接近60%（圖3（a））。此外，初級纖毛發(fā)生率還與照射處理后檢測時間點相關，10 Gy X射線照射后72 h 時，M059K 細胞的初級纖毛發(fā)生率進一步升高至（78.40±2.28）%。然而，M059J 細胞初級纖毛發(fā)生率在X 射線照射前后無明顯變化（圖3（a））。值得注意的是，隨著吸收劑量的增加，M059K 細胞中多纖毛細胞和異常結(jié)構纖毛細胞的比例明顯升高（圖3（b）），提示X射線引起的初級纖毛發(fā)生和纖毛結(jié)構異常可能與M059K 細胞較高的輻射耐受能力相關。以上結(jié)果表明，X射線能促進M059K 細胞纖毛發(fā)生，并且X 射線誘導初級纖毛發(fā)生的作用具有劑量和時間效應。

圖3 X射線對M059K細胞初級纖毛發(fā)生的影響：(a)不同劑量X射線照射M059K和M059J細胞后的初級纖毛發(fā)生率；(b)X射線照射后M059K的多纖毛細胞免疫熒光圖像（Arl13b（紅色）表示初級纖毛，γ-Tub（綠色）表示基體，DAPI（藍色）表示細胞核，彩色見電子版）；*p＜0.05,照射組vs.對照組Fig.3 Effects of X-ray on ciliogenesis in M059K cells:(a)quantification of the ciliated cells in M059K and M059J cells exposed to X-ray irradiation;(b)immunofluorescence images of multi-ciliated cells in M059K cells exposed to X-ray irradiation(primary cilia were stained for Arl13b(red)and γ-Tub(green),and the nuclei were stained with DAPI(blue),color online);*p＜0.05,ionizing radiation group vs.control group

2.4 初級纖毛調(diào)控神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的輻射敏感性

上述結(jié)果證實初級纖毛與神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞輻射敏感性相關，且電離輻射能夠促進M059K 細胞初級纖毛發(fā)生，然而初級纖毛是否具有調(diào)控M059K細胞的輻射敏感性的功能仍未明確。目前，通常采用siRNA技術敲低IFT88基因表達達到干擾初級纖毛發(fā)生的效果［16］。M059K細胞轉(zhuǎn)染siIFT88后，免疫熒光結(jié)果顯示，抑制IFT88基因表達能有效降低X 射線引起的初級纖毛發(fā)生，且初級纖毛平均長度明顯變短（圖4（a））。以SF2 評估M059K 細胞的電離輻射敏感性，細胞經(jīng)X 射線或碳離子束照射處理后克隆存活實驗結(jié)果顯示（圖4（b）、（c）），轉(zhuǎn)染siIFT88 干擾初級纖毛發(fā)生后與陰性對照相比，細胞SF2 值在X 射線照射時由0.58±0.05 降至0.21±0.04（p＜0.01），在碳離子束照射時由0.37±0.04降至0.19±0.02（p＜0.05），表明靶向初級纖毛能顯著提高M059K細胞的輻射敏感性，同時提示初級纖毛可能參與調(diào)控M059K 細胞的輻射敏感性。

圖4 干擾初級纖毛提高神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的輻射敏感性：(a)M059K細胞在siIFT88干擾初級纖毛以及X射線照射后的免疫熒光圖像（白色箭頭指示初級纖毛，Arl13b(紅色)表示初級纖毛，γ-Tub(綠色)表示基體，DAPI(藍色)表示細胞核，彩色見電子版）；(b)siIFT88或NC處理M059K細胞并在2 Gy X射線或碳離子照射下形成的細胞克隆圖像；(c)X射線或碳離子束照射下M059K細胞的SF2定量分析；*p＜0.05，**p＜0.01，siIFT88 vs.NCFig.4 Interference of primary cilia enhances the radiosensitivity of glioblastoma cells:(a)immunofluorescence images of primary cilia treated with siIFT88 in IR-exposed M059K cells(white arrows indicate primary cilia;primary cilia were stained for Arl13b(red)and γ-Tub(green),and the nuclei were stained with DAPI(blue),color online);(b)photographs of colonies formed by M059K cells treated with siIFT88 or NC and exposed to 2 Gy of X-rays or carbon ions irradiation;(c)SF2 of M059K cells exposed to X-ray or carbon ion irradiation;*p＜0.05,**p＜0.01,siIFT88 vs.NC

3 討論

初級纖毛作為細胞的“天線”，通過調(diào)控Hedgehog、Wnt、TGF-β、Notch 等多種信號通路感應物理、化學和生物信號刺激，其結(jié)構和功能異常會導致一系列疾病［17-18］，包括腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［19］。一方面，研究發(fā)現(xiàn)多種類型的腫瘤細胞缺失初級纖毛［4-6］，通過藥物誘導初級纖毛能有效抑制腫瘤細胞增殖［20］；另一方面，人基底細胞癌等部分類型腫瘤細胞高度依賴于初級纖毛介導的Hedgehog 通路，抑制初級纖毛能夠有效降低細胞活性［21］。此外，在人宮頸癌和胃腸道間質(zhì)瘤等類型的腫瘤中同樣保留了一定比例具有初級纖毛的腫瘤細胞［7-8］，表明初級纖毛是維持腫瘤細胞功能所必需的重要細胞器。本研究發(fā)現(xiàn)，人神經(jīng)膠質(zhì)瘤M059K 和M059J 均具有初級纖毛，這與早期神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞及組織檢測到初級纖毛的報道結(jié)果相一致［22］。然而，初級纖毛在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞中發(fā)揮的生物學功能仍有待研究。

電離輻射是否影響腫瘤細胞初級纖毛發(fā)生還未見有相關的報道。本研究首次發(fā)現(xiàn)電離輻射（X射線和碳離子束）能夠促進神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞M059K初級纖毛的發(fā)生和延長（圖3（a）），并且隨著輻照劑量的增加多纖毛和異常纖毛細胞比例也相應提高（圖3（b）），這與Filipova等［12］在人成肌細胞C2C12 及Shimada 等［13］在人永生化視網(wǎng)膜色素上皮細胞hTERT-RPE1中獲得的研究結(jié)果一致。這些結(jié)果證明電離輻射不僅能誘導正常細胞的初級纖毛發(fā)生，同樣能促進腫瘤細胞初級纖毛發(fā)生，而電離輻射引起初級纖毛發(fā)生率的提高在正常細胞和腫瘤細胞中是否會產(chǎn)生相似的生物學效應是值得關注和研究的重要問題。

M059K 和M059J 是來源于同一神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者 的DNA-PKcs （DNA-dependent protein kinase catalytic subunit）基因狀態(tài)不同的兩種細胞系，M059K 為野生型，而M059J 為缺失型［23］。DNAPKcs 屬于PIKK（Phosphoinositide-3-kinase-related protein kinase）家族，是一種絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶。PIKK家族是DNA損傷應答和修復的關鍵調(diào)節(jié) 因 子 ， 包 括 ATM （Ataxia-telangiectasia mutated）、 ATR （Ataxia-telangiectasia and Rad3-related）、DNA-PKcs 及mTOR（Mammalian target of rapamycin）等成員［24］。研究證實ATM、ATR及mTOR均是調(diào)控初級纖毛發(fā)生的重要因子［25-27］。本研究結(jié)果表明，DNA-PKcs 野生型細胞M059K 經(jīng)電離輻射處理后初級纖毛發(fā)生率和長度均顯著提高，而DNA-PKcs缺失型細胞M059J則無明顯變化（圖3（a））。此外，我們前期研究發(fā)現(xiàn)部分腫瘤細胞經(jīng)電離輻射處理后發(fā)生G2期長期阻滯并進入衰老狀態(tài)［28］，同時伴隨著PIKK 家族下游因子Aurora A、Plk1 等周期調(diào)控蛋白的降解［29］，而Aurora A、Plk1 及KIF2 等的降解和激活與初級纖毛的發(fā)生及解聚直接相關［30-31］。因此，我們推測在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞中DNA-PKcs同樣是初級纖毛發(fā)生和延長所需要的，而電離輻射可能通過激活DNAPKcs 而影響下游Aurora A 和Plk1 等周期調(diào)控蛋白的活性，最終導致初級纖毛的發(fā)生和延長。

研究普遍認為DNA-PKcs 基因的缺失是造成M059J 細胞輻射敏感性遠高于M059K 細胞的關鍵原因［32］。我們的結(jié)果提示初級纖毛發(fā)生率的差異同樣影響兩種細胞的輻射敏感性（圖（1）、（2）），并且電離輻射處理時，M059K細胞的初級纖毛發(fā)生率進一步提高，而M059J 則無明顯變化（圖（3））。干擾初級纖毛發(fā)生能顯著增強M059K的輻射敏感性（圖4（c）），這些結(jié)果暗示初級纖毛及其相關的信號通路在調(diào)控細胞輻射應激響應及輻射敏感性進程中同樣發(fā)揮著重要作用。值得關注的是，Hedgehog 通路的激活高度依賴于初級纖毛［33］，其下游靶基因涉及抗凋亡和激活自噬等多種促進細胞存活的功能［34］。由此推測電離輻射有可能通過促進M059K 細胞初級纖毛發(fā)生和延長而異常激活Hedgehog 通路，從而使細胞抵抗電離輻射引發(fā)的細胞凋亡提高了存活能力，但具體的機制仍需進一步探索和驗證。

綜上所述，本研究首次揭示了電離輻射影響人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞初級纖毛發(fā)生的生物學現(xiàn)象，證明了初級纖毛具有調(diào)控腫瘤細胞輻射敏感性的生物學功能，為研究神經(jīng)膠質(zhì)瘤在內(nèi)的腫瘤放療抵抗的分子機制提供了新思路，同時為腫瘤放療增敏提供了新靶點和理論依據(jù)。