張 斌， 郭 民， 王海龍， 宋國華 (山西醫(yī)科大學實驗動物中心， 太原 030001;通訊作者，E-mail:ghsongg@yahoo.com.cn)

細胞凋亡即程序性細胞死亡，是多細胞生物更新正常細胞和清除異常細胞的重要手段。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)在凋亡信號傳遞中起關(guān)鍵作用，甚至有人認為它是凋亡的執(zhí)行者［1］。氟對雄性生殖系統(tǒng)有毒性作用，可直接作用于睪丸、附睪、前列腺等，破壞其結(jié)構(gòu)，導致生育能力的下降［2］。研究表明間質(zhì)細胞受損，線粒體和滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的變化顯著，可能通過增強脂質(zhì)過氧化作用，抑制物質(zhì)和能量代謝過程，損傷DNA等途徑對雄性生殖系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能造成直接損害［3］。本實驗通過觀察氟化鈉對體外培養(yǎng)的小鼠睪丸間質(zhì)細胞進行染毒，觀察間質(zhì)細胞凋亡以及caspase-3表達的變化，進一步證實氟化鈉對間質(zhì)細胞的毒性作用，為氟中毒的雄性生殖系統(tǒng)損傷機制的研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 細胞 本實驗室培養(yǎng)的小鼠睪丸間質(zhì)細胞。取睪丸間質(zhì)細胞，待細胞單層長滿95%左右后，將培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)液棄掉，先用1 ml左右的消化液潤洗培養(yǎng)瓶，棄去消化液，再加2 ml左右新鮮的消化液，當單層細胞呈白色，細胞間出現(xiàn)裂縫且細胞開始收縮時棄掉消化液，終止消化;加入10 ml DMEM/F12培養(yǎng)基，用吸管吹打散開。將一瓶傳兩瓶，如果生長不好，濃度不高，但又需要傳代時也可采用原瓶傳原瓶的方式。傳代后幾小時就可以觀察到先貼壁的間質(zhì)細胞，表示傳代成功。傳代細胞培養(yǎng)溫度條件為37℃，密封培養(yǎng)。取第3代睪丸間質(zhì)細胞接種于蓋玻片上，細胞接種密度為1×106個/ml，待細胞長至匯合后取出蓋玻片，以常規(guī)3β-HSD法染色鑒定。

1.2 主要試劑和儀器 DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco公司);胎牛血清(杭州四季青公司);胰蛋白酶(Gibco公司);膠原酶(Sigma公司);超凈工作臺(哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司);CO2培養(yǎng)箱(Forma scientific美國);超低溫冰箱(Sanyo公司);氟化鈉(分析純，天津化學試劑廠);Annexin-Ⅴ-FITC(Sigma公司);casepase-3試劑盒(武漢博士德生物公司)。

1.3 染毒處理 細胞生長增殖形成單層細胞，鏡下觀察以1×106/ml接種于預置玻片的6孔培養(yǎng)板，每孔1 ml。48 h后棄舊培養(yǎng)液，PBS洗滌后換為含不同濃度氟化鈉的培養(yǎng)液，參考毒理學實驗一般進行低、中、高劑量染毒和氟化鈉對大鼠成骨細胞的研究［4］，本實驗氟化鈉的濃度設為 0 mg/L、5 mg/L、10 mg/L和20 mg/L。37℃恒溫混合氣體(5%CO2和95%O2)環(huán)境中培養(yǎng)，隔天換液。于不同時間在倒置顯微鏡下觀察成骨細胞的生長情況和形態(tài)變化。1.4 睪丸間質(zhì)細胞凋亡的測定 各組細胞每個濃度設6個重復組。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，用0.25%胰蛋白酶消化并離心收集各組細胞。用PBS洗滌細胞3次;1×binding buffer重新懸浮細胞至1×106/ml;取100 μl細胞至5 ml管;加入5 μl Annexin-Ⅴ-FITC，5 μl碘化丙錠(PI)混勻;于室溫避光孵育15 min;每管加入300 μl 1 × binding buffer，1 h 內(nèi)用流式細胞儀檢測熒光強度［5］。

1.5 caspase-3蛋白表達的測定 調(diào)節(jié)細胞濃度為1×106/ml;將細胞培養(yǎng)于載玻片，載玻片置于6孔板內(nèi)，先生長約4 h，使細胞貼壁后再小心加入培養(yǎng)基3 ml，常規(guī)培養(yǎng)48 h，選對數(shù)生長期細胞用于實驗。

分組:PBS洗滌后換為含不同濃度氟化鈉(0 mg/L，5 mg/L，10 mg/L，20 mg/L)的培養(yǎng)液，每組設3個復孔。

固定:氟作用48 h后，用PBS(pH 7.2)緩慢沖洗3次，倒掉PBS，加入4%多聚甲醛室溫下固定30 min，蒸餾水沖洗3次，每次2 min，取出載玻片。30%H2O21份+蒸餾水10份混合，室溫5－10 min以滅活內(nèi)源性酶;蒸餾水洗3次。滴加5%BSA封閉液，室溫20 min，甩去多余液體。加入caspase-3適當稀釋的一抗(1∶100)，37℃30 min，然后4℃過夜;加入二抗4℃過夜后取出，室溫放置10 min，PBS洗3次，每次5 min;滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，37 ℃ 20 min。PBS(pH7.2－7.6)洗2 min×3次。滴加SABC，20－37℃ 20 min。PBS(pH7.2－7.6)洗5 min×4次。

DAB顯色:使用DAB顯色試劑盒(AR1022)。取1 ml蒸餾水，加試劑盒中A，B，C試劑各1滴，混勻后加至切片。室溫顯色，鏡下控制反應時間，至出現(xiàn)棕黃色陽性顆粒時，蒸餾水洗滌。

蘇木素復染細胞核10 min，1%鹽酸酒精分化，鏡下控制，自來水返藍10 min;脫水、透明:70%、80%、90%、100%、100%酒精各 5 min，二甲苯 10 min;封片:中性樹膠封片。

1.6 顯微圖像分析 在光學顯微鏡OlympusAX70下觀察切片，從每組中選取8－10張切片，每張切片隨機選取5－7個視野，利用BI-2000醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)將圖像采集并轉(zhuǎn)化到計算機中，通過MetaMorph4.5圖像分析軟件自動測定每個視野陽性細胞的灰度值，并計算其平均值。

1.7 統(tǒng)計學分析 采用SPSS11.5軟件進行統(tǒng)計處理，計量資料以±s表示，方差齊的多組比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗，P＜0.05差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 氟對體外培養(yǎng)小鼠睪丸間質(zhì)細胞形態(tài)的影響

在倒置顯微鏡下觀察時，實驗組(5，10，20 mg/L)24 h內(nèi)睪丸間質(zhì)細胞的數(shù)量增多，形態(tài)變化不明顯;從24 h開始細胞數(shù)量開始少于正常對照組，細胞數(shù)量顯著下降，細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，睪丸間質(zhì)細胞呈明顯的長梭形、星形，細胞收縮變形，細胞間隙增大。各處理組隨著氟濃度的增高和時間的延長，細胞的變化逐漸明顯。對照組細胞生長旺盛，細胞形態(tài)自然。

2.2 氟誘導體外培養(yǎng)小鼠睪丸間質(zhì)細胞凋亡的影響 實驗小鼠經(jīng)不同濃度氟化鈉(0 mg/L，5 mg/L，10 mg/L，20 mg/L)染毒48 h后，間質(zhì)細胞凋亡結(jié)果見表1和圖1，各實驗組與同期對照組比較差異顯著(P ＜0.01)。結(jié)果表明，5，10，20 mg/L 的氟作用于小鼠睪丸間質(zhì)細胞均可誘導小鼠睪丸間質(zhì)細胞發(fā)生凋亡。20 mg/L氟作用48 h后，早期凋亡率最高，10 mg/L氟作用48 h后，晚期凋亡率最高，染氟各組小鼠睪丸間質(zhì)細胞凋亡率高于同期對照組(P＜0.01)。各染氟小鼠睪丸間質(zhì)細胞凋亡率隨染氟劑量的增加逐漸升高。結(jié)果提示，一定劑量的氟化鈉能引起小鼠睪丸間質(zhì)細胞凋亡率的升高。

表1 不同濃度氟化鈉干預48 h的間質(zhì)細胞的凋亡率(±s)Tab 1 Leydig cell apoptosis rate after treated with different concentrations of sodium fluoride for 48 h(±s)

表1 不同濃度氟化鈉干預48 h的間質(zhì)細胞的凋亡率(±s)Tab 1 Leydig cell apoptosis rate after treated with different concentrations of sodium fluoride for 48 h(±s)

與同期0 mg/L(對照組)比較，*P＜0.01

?

2.3 氟對體外培養(yǎng)小鼠睪丸間質(zhì)細胞caspase-3表達的影響 免疫組化結(jié)果顯示，對照組染色細胞數(shù)少且著色淺，睪丸間質(zhì)細胞胞質(zhì)內(nèi)可見少量棕黃色顆粒，表明caspase-3表達弱;5 mg/L組睪丸間質(zhì)細胞胞質(zhì)內(nèi)可見較多的棕黃色顆粒沉積，caspase-3表達強;10 mg/L和20 mg/L組細胞核周圍均被染成棕黃色(見圖2)，caspase-3強表達。caspase-3在睪丸間質(zhì)細胞胞質(zhì)中表達，隨著氟濃度的增高，間質(zhì)細胞細胞胞膜和胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒也增多。圖像分析結(jié)果說明caspase-3灰度值在20 mg/L組低于10 mg/L組。由此可見，隨著氟濃度的增加，灰度值降低。因此，氟濃度與caspase-3灰度值呈負相關(guān)，即陽性率越高，灰度值越低，蛋白表達越強。

圖1 不同濃度氟化鈉干預48 h的間質(zhì)細胞的凋亡率Fig 1 The apoptosis of Leydig cell after treated with different concentrations of sodium fluoride for 48 h by flow cytometry

表2 不同濃度氟化鈉組caspase-3表達的平均灰度值(±s，n=30)Tab 1 Average gray value of caspase-3 expression after treated with different concentrations of sodium fluoride(±s，n=30)

表2 不同濃度氟化鈉組caspase-3表達的平均灰度值(±s，n=30)Tab 1 Average gray value of caspase-3 expression after treated with different concentrations of sodium fluoride(±s，n=30)

與0 mg/L(對照組)比較，*P ＜0.01

?

3 討論

細胞凋亡既是間質(zhì)細胞發(fā)育中的重要方式，又是致畸因素導致間質(zhì)細胞異常發(fā)育的重要形式［6，7］。因此，細胞凋亡的研究有助于間質(zhì)細胞發(fā)育機制的闡明。實驗采用體外培養(yǎng)方式，用氟化鈉染毒，觀察其對小鼠間質(zhì)細胞凋亡的影響，這樣可以排除動物個體因素的干擾。結(jié)果在對照組和低高劑量氟化鈉組均觀察到亞二倍體峰值的顯著變化(P＜0.01)，說明存在細胞凋亡。同時也證實氟化鈉隨著濃度的增加，細胞凋亡也增強，因為亞二倍體峰值高劑量氟化鈉組與空白對照組和低劑量氟化鈉組相比均存在統(tǒng)計學差異。

圖2 caspase-3的陽性表達細胞形態(tài)(免疫組織化學染色，×200)Fig 2 Caspase-3 positive expression in each group(immunohistochemical staining，×200)

細胞凋亡是細胞受死亡信號刺激后發(fā)生的主動性細胞死亡過程。凋亡不足時，易發(fā)生自身免疫性疾病、病毒性疾病和癌變等，這個過程涉及到多個家族的蛋白質(zhì)。目前已證明caspase家族在誘導細胞凋亡的分子機制中起關(guān)鍵作用，是多條凋亡通路的匯聚點，是執(zhí)行凋亡的最終途徑。在caspase級聯(lián)反應中，caspases-3處于核心位置。caspases-3被其上游信號激活，活化的caspases-3又進一步作用于其底物導致 caspase級聯(lián)反應放大，最終使細胞凋亡［8］。有研究報道關(guān)于氟對大鼠成骨細胞中與凋亡密切相關(guān)的caspase家族的兩個基因caspase-3和caspase-9基因mRNA表達量的檢測，發(fā)現(xiàn)染氟24 h后，氟的刺激沒有引起caspase-3和caspase-9基因mRNA表達量的變化，當氟作用72 h后，5 mg/L NaF組的caspase-3和caspase-9基因mRNA表達量明顯升高，分別是對照組的2.03和2.23倍，推斷氟導致細胞色素C與Apaf-1激活，然后進一步激活caspase-9，進而激活 caspase-3最終導致細胞凋亡［4］。實驗發(fā)現(xiàn)在實驗組睪丸間質(zhì)細胞中，caspase-3表達都呈陽性;但與0 mg/L組相比，5 mg/L組氟化鈉組睪丸間質(zhì)細胞中caspase-3表達的平均灰度值無統(tǒng)計學差異，而與0 mg/L組和5 mg/L氟化鈉組相比，高劑量氟化鈉組caspase-3表達的平均灰度值均存減少。結(jié)果證實了caspase-3是睪丸間質(zhì)細胞發(fā)育過程中的重要的細胞因子之一，參與正常和異常間質(zhì)細胞發(fā)育調(diào)節(jié)。同時也證實了隨著氟化鈉濃度的增加，細胞凋亡也增強。

有報道認為caspase半胱氨酸蛋白酶家族引發(fā)的級聯(lián)反應是細胞凋亡過程的中心環(huán)節(jié)，其激活主要包括線粒體依賴途徑和死亡受體介導的信號傳導途徑，激活后的下游caspase通過切割特異性底物，導致細胞凋亡。其中caspase-3處于caspase蛋白酶系的核心地位，可作用于多種底物，其底物改變與細胞凋亡表型密切相關(guān)，在caspase酶系級聯(lián)反應中發(fā)揮重要作用［9，10］。那么，氟化鈉通過何種方式激活caspases前體蛋白，還需要后續(xù)的實驗作進一步探討。

［1］ Liu J，Liu J，Mao J，et al.Caspase-3-mediated cyclic stretch-induced myoblast apoptosis via a Fas/FasL-independent signaling pathway during myogenesis［J］.J Cell Biochem，2009，107(4):834－844.

［2］ 崔留欣，姜春霞，王錫林，等.氟致雄性大鼠生殖功能損害的實驗研究［J］.中國地方病學雜志，2003，22(3):195 －197.

［3］ 袁雙虎.睪丸間質(zhì)細胞凋亡及調(diào)控［J］.中華男科學，2003，9(3):218－225.

［4］ Yan X，Yan X，Morrison A，et al.Fluoride induces apoptosis and alters collagen I expression in rat osteoblasts［J］.Toxicol Lett，2011，200(3):133 －138.

［5］ 劉純，孫圣華，張強，等.不同濃度的維生素C對C2C12成肌細胞增殖和凋亡的影響［J］.中南大學學報:醫(yī)學版，2010，35(7):732－737.

［6］ Esfandiari N，F(xiàn)alcone T，Goldberg JM.Heat-shock proteins modulate the incidence of apoptosis and oxidative stress in preimplantation mouse embryos［J］.Fertil Steril，2007，87(5):1214 －1217.

［7］ Pantaleon M，Kaye PL.Glucose transporters in preimplantation development［J］.Rev Reprod，1998，3(2):77 －81.

［8］ Fan TJ，Han LH，Cong RS，et al.Caspase family proteases and apoptosis［J］.Acta Biochim Biophys Sin，2000，37(11):719 －727.

［9］ Budihardjo I，Oliver H，Lutter M，et al.Biochemical pathways of caspase activation during apoptosis［J］.Annu Rev Cell Dev Biol，1999，15:269 －290.

［10］ Cikala M，Wilm B，Hobmayer E，et al.Identification of caspases and apoptosis in the simple metazoan Hydra［J］.Curr Biol，1999，9(17):959－962.