張國(guó)紅，陳宋明

缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF－1α)是機(jī)體細(xì)胞在低氧環(huán)境中產(chǎn)生的一種轉(zhuǎn)錄因子，參與低氧反應(yīng)基因的調(diào)控，可促進(jìn)血紅素氧化酶－1(HO－1)、血管生長(zhǎng)因子(VEGF)等因子的表達(dá)。HO－1具有抗氧化、抗炎、擴(kuò)張血管作用，被認(rèn)為是血管保護(hù)因子［1］。研究證實(shí)HIF誘導(dǎo)的HO－1對(duì)缺血－再灌注損傷具有長(zhǎng)期的心肌保護(hù)作用［2］。本研究檢測(cè)冠心病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞HIF－1α和HO－1表達(dá)水平，探討冠心病患者HIF－1α與HO－1表達(dá)的相關(guān)性，為誘導(dǎo)HO－1治療冠心病提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇本院2006年4月—2007年12月因冠心病心絞痛或急性心肌梗死入院并在入院后行冠狀動(dòng)脈造影檢查確診為冠心病的患者為研究對(duì)象，共95例，其中急性心肌梗死患者35例(AMI組)，其余患者按入院前心絞痛的發(fā)作特點(diǎn)分為穩(wěn)定型心絞痛組(SAP組，勞累性心絞痛發(fā)作的性質(zhì)在1～3個(gè)月內(nèi)無改變)，30例;不穩(wěn)定型心絞痛組(UAP組，包括除穩(wěn)定型心絞痛以外的其他類型心絞痛)，30例。選擇經(jīng)冠脈造影證實(shí)冠脈正常的30例患者作為對(duì)照組。所有研究對(duì)象檢查前4周無感染、創(chuàng)傷史。同時(shí)記錄患者的高血壓、糖尿病、高血脂及吸煙史。

1.2 方法

1.2.1 外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離 取研究對(duì)象外周抗凝血10 m l，用Hank'S液稀釋1倍后加于10 ml單個(gè)核細(xì)胞分離液上(天津中科院生物醫(yī)學(xué)工程研究所)，2 000r/min速度離心20 min，吸取單個(gè)核細(xì)胞層(主要為淋巴細(xì)胞)，用Hank'S液沖洗3次(1 200 r/min)，沉淀物用凍存液－80℃保存，以備行Western blot檢測(cè)。

1.2.2 Western blot印跡 應(yīng)用單細(xì)胞裂解液裂解單個(gè)核細(xì)胞，離心后取上清液，利用PCA法測(cè)定蛋白含量，以每孔50μg蛋白量用緩沖液緩沖后煮沸5 min，蛋白變性后用微量加液器以每孔50μl加樣，穩(wěn)壓60 V在12%聚丙烯酰胺凝膠電泳4 h，再進(jìn)行蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移(轉(zhuǎn)移槽60 V轉(zhuǎn)膜3 h)。轉(zhuǎn)膜后麗春紅染色5 min，5%脫脂奶粉4℃封閉過夜。將膜泡于含HO－1一抗和HIF－1α的新鮮配制的5%脫脂奶粉溶液中(HO－1一抗為多克隆兔抗HO－1，美國(guó)ALEXIS公司出品，稀釋度1∶400;HIF－1α一抗為鼠抗HIF－1α單克隆抗體，Warm Springs Blvd Fremont CA出品，稀釋度1∶400)，室溫下孵育2 h，TGCT液洗膜2次，用同法加二抗(HO－1二抗為羊抗兔IgG，武漢博士德公司產(chǎn)品;HIF－1α二抗為兔抗鼠，Sigma公司產(chǎn)品)，二抗稀釋度1∶500，室溫下反應(yīng)2 h。免疫反應(yīng)后的膜蓋于發(fā)光試劑(北京中山試劑公司)反應(yīng)1 min，膜吸干后蓋于相應(yīng)大小的X線片上，暗室暴光5 min，X線片經(jīng)顯影定影后晾干待檢。將Wstern blot結(jié)果掃描進(jìn)計(jì)算機(jī)，再用Sigma pro自動(dòng)圖像分析軟件對(duì)HO－1光帶進(jìn)行分析，以HO－1蛋白帶的灰度峰值代表HO－1的表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用(x－±s)表示，組間差異比較采用單因素方差分析及χ2檢驗(yàn)，采用相關(guān)分析方法分析指標(biāo)間相關(guān)性，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象一般情況比較 冠心病患者AMI、UAP、SAP組及對(duì)照組臨床資料及危險(xiǎn)因素比較，各指標(biāo)間差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05，見表1)。

2.2 Western blot結(jié)果 與對(duì)照組相比，AMI組、UAP組患者HO－1和HIF－1α蛋白表達(dá)均明顯增多，SAP組HO－1和HIF－1α蛋白表達(dá)增多不明顯。相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，在總體水平上，HO－1、HIF－1α蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.76);在AMI組、UAP組與SAP組HO－1、HIF－1α蛋白表達(dá)也存在正相關(guān)(r值分別為0.79、0.89、0.75，P ＜0.01，見圖 1，表 2)。

表1 各組研究對(duì)象臨床資料及冠心病危險(xiǎn)因素比較Table 1 The clinical information and risk factors in different groups

圖1 各組冠心病患者及對(duì)照者HIF－1α與HO－1的表達(dá)Figure 1 Expression of HIF－1αand HO－1 in different groups

表2 各組蛋白印跡圖像分析結(jié)果比較 (x－±s)Table 2 Expression of HIF－1αand HO－1 in different groups

3 討論

冠心病是威脅公眾健康的全球性疾病，其發(fā)生、發(fā)展有賴于作用于冠狀動(dòng)脈的損害因素和保護(hù)因素相互作用的結(jié)果。近年研究表明，HO－1是一個(gè)血管保護(hù)因子，冠狀動(dòng)脈壁HO－1表達(dá)水平將直接影響冠心病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后［3］。本課題組的前期研究已發(fā)現(xiàn)冠心病患者HO－1表達(dá)水平高于冠狀動(dòng)脈正常者，HO－1表達(dá)水平與冠心病嚴(yán)重程度顯著相關(guān)［4－5］。在此基礎(chǔ)上，本研究觀察了HO－1上游調(diào)控因子HIF－1α蛋白表達(dá)情況，并探討兩者的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HIF－1α蛋白表達(dá)也與冠心病嚴(yán)重程度密切相關(guān)，且HO－1與HIF－1α蛋白表達(dá)間存在正相關(guān)關(guān)系。

HIF－1α是細(xì)胞暴露于缺氧環(huán)境后各種病理和生理反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子。HIF－1α在常氧下分解，在低氧下穩(wěn)定，HIF－1α和HIF－1β都是HIF－1的亞單位，HIF－1β的表達(dá)不受細(xì)胞內(nèi)氧濃度的影響，而HIF－1α的表達(dá)卻直接由低氧誘導(dǎo)。缺氧時(shí)，HIF－1α不被分解，并啟動(dòng)包括與HIF－1β聚合在內(nèi)的多個(gè)激活步驟［6］。

HIF－1α參與對(duì)低氧反應(yīng)基因的調(diào)控，可以促進(jìn)VEGF、促紅細(xì)胞生成素 (EPO)、HO－1等因子的表達(dá)。HIF－1α?xí)鹧苄律⒀芷交∈婵s、抑制血小板凝聚、紅細(xì)胞增生而緩解冠心病患者心肌缺血［7］。HIF－1α表達(dá)上調(diào)可以促進(jìn)致密血管的增生，增加心肌組織血供，減少心肌梗死面積［8］。HIF誘導(dǎo)的HO－1對(duì)缺血－再灌注損傷具有長(zhǎng)期的心肌保護(hù)作用［2］。本研究發(fā)現(xiàn)，AMI組、UAP組與SAP組HIF－1α蛋白的表達(dá)差異明顯，提示HIF－1α蛋白表達(dá)與臨床表型密切相關(guān)，證實(shí)了HIF－1α對(duì)冠心病患者缺血后心肌的保護(hù)作用。

HO－1為可誘導(dǎo)型血紅素氧化酶，在缺氧、氧化應(yīng)激、中毒等情況下表達(dá)明顯增加［9］。HO－1存在于血液中單個(gè)核細(xì)胞胞質(zhì)微粒體，也分布于網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞含量豐富的組織如肝臟、脾臟，其他組織細(xì)胞在氧化應(yīng)激狀態(tài)下也有不同程度的表達(dá)。近幾年研究表明，HO－1對(duì)心血管系統(tǒng)起重要的保護(hù)作用:通過抗氧化作用保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞及心肌細(xì)胞［10］;通過調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)減少內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，保護(hù)內(nèi)皮系統(tǒng)的穩(wěn)定性，同時(shí)促進(jìn)血管平滑肌凋亡，減輕血管損傷后的不良重構(gòu);直接抑制心肌細(xì)胞肥大，降低左室/體質(zhì)量比例;催化產(chǎn)生內(nèi)源性一氧化氮，直接擴(kuò)張血管。HO－1是體內(nèi)重要的抗動(dòng)脈粥樣硬化因子之一［11］。眾多試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HO－1高表達(dá)可降低冠心病患者冠脈介入術(shù)后再狹窄率［12－13］，其高表達(dá)也能降低冠心病死亡率，減少冠脈事件發(fā)生率［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，HO－1的表達(dá)在AMI、UAP與SAP組中有明顯差異，提示HO－1表達(dá)與臨床表型密切相關(guān)的同時(shí)也進(jìn)一步提供了HO－1表達(dá)的上調(diào)影響缺血后適應(yīng)心肌保護(hù)作用相關(guān)的證據(jù)［15］。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)HIF－1α蛋白表達(dá)與冠心病嚴(yán)重程度密切相關(guān)，提示心肌缺氧面積可能與HIF－1α表達(dá)水平相關(guān)，檢測(cè)HIF－1α表達(dá)水平可間接反應(yīng)冠心病嚴(yán)重程度，也反映了機(jī)體對(duì)缺氧心肌的一種自身保護(hù)機(jī)制。另外，HIF－1α/HO－1蛋白表達(dá)之間存在正相關(guān)關(guān)系反映體內(nèi)保護(hù)因素之間存在著調(diào)控關(guān)系，證實(shí)了在冠心病發(fā)生、發(fā)展過程中HIF－1α/HO－1被激活，從蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用角度闡明影響HO－1表達(dá)水平的分子機(jī)制。本研究證實(shí)HIF－1α是冠心病患者內(nèi)源性保護(hù)因子HO－1表達(dá)水平的重要調(diào)控因子，為誘導(dǎo)HO－1的表達(dá)用于冠心病的治療奠定了基礎(chǔ)。

1 Foresti R，Goatly H，Green CJ，et al．Role of heme oxygenase－1 in hypoxia－reoxygenation:requirement of substrate heme to promote cardioprotection ［J］．Am JPhysiol Heart Circ Physiol，2001，281(5):1976－1984．

2 劉磊，趙榮瑞.低氧誘導(dǎo)因子－1及其在缺血性心臟疾病中的作用［J］．生理科學(xué)進(jìn)展，2006，37(3):251－254．

3 Larsen K，Cheng C，Duckers HJ．Regulation of vulnerable plaque development by the heme oxygenase/carbonmonoxide system ［J］．Trends Cardiovasc Med，2010，20(2):58－65．

4 Chen SM，Li YG，Wang DM．Studys on changes of heme oxygenase－1 expression in patientswith coronary heart disease［J］．Clinical Cardiology，2005，28(4):197－201．

5 Li YG，Wang DM，Chen SM，et al．Heme Oxygenase－1 expression and coronary heart disease－association between levels of heme oxygenase－1 expression and angiographic morphology as well as quantity of coronary lesions［J］．ACTA Cardiol，2006，61(3):295 －300．

6 Wang GL，Jiang BH，Rue EA，etal．Hypoxia－inducible factor1 isa basic－h(huán)elix－loop－h(huán)elix－PAS heterodimer regulated by cellular O2 tension［J］．Proc Natl Acad Sci USA，1995，92(12):5510 －5514．

7 Buddhadeb D，Roberto B．HO－1 induction by HIF－1:a new mechanism for delayed cardioprotection?［J］．Am JPhysiol Heart Circ Physiol，2005，289(2):522 －524．

8 Ockaili R，Natarajan R，Salloum F，et al．HIF －1 activation attenuates postischemicmyocardial injury:role for heme oxygenase－1 inmodulating HIF－1 in modulatingmicrovascular chemokine generation［J］．Am JPhysiol Heart Circ Physiol，2005，289(2):542 －548．

9 沈承瀾，沈振斌，陳偉東.血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、缺氧誘導(dǎo)因子－1α在胃癌中的表達(dá)及其對(duì)預(yù)后影響的研究［J］．中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2010，13(8):2460．

10 DuranteW．Heme oxygenase－1 in growth control and its clinical application to vascular disease ［J］．JCell Physiol，2003，195(3):373－382．

11 Yet SF，Tian R，Layne MD，et al．Cardiac－specific expression of hemeoxygenase－1 protects against ischemia and reperfusion injury in transgenic mice［J］．Circ Res，2001，89(2):168－173．

12 Chen YH，Chau LY，Lin MW，et al．Heme oxygenase－1 gene promotormicrosatellite polymorphism is associated with angiographic restenosis after coronary stenting ［J］．Eur Heart J，2004，25(1):39－47．

13 Gulesserian T，Wenzel C，Endler G，et al．Clinical restenosis after coronary stent implantation is associated with the heme oxygenase－1 gene promoter polymorphism and the heme oxygenase－1+99G/C variant［J］．Clin Chem，2005，51(9):1661－1665．

14 Dick P，Schillinger M，Minar E，et al．Haem oxygenase－1 genotype and cardiovascular adverse events in patientswith peripheral artery disease［J］．Eur JClin Invest，2005，35(12):731 －737．

15 Wang G，Hamid T，Keith RJ，et al．Cardioprotective and antiapoptotic effects of heme oxygenase－1 in the failing heart［J］．Circulation，2010，121(17):1912－1925．