張之齡，尹小燕，童小文，朱健

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院急診科，上海200011)

膿毒癥是臨床上常見的急危重癥之一，為嚴(yán)重感染引起的不可控制的全身性炎性反應(yīng)，可迅速發(fā)展為膿毒性休克和多器官功能障礙綜合征(MODS)。肺臟是這一連貫病理過程中最早也最易受累的靶器官，臨床表現(xiàn)為急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征［1］(ALI/ARDS)。雖然ALI的具體發(fā)病機(jī)制仍不明確，但研究［2］發(fā)現(xiàn)高遷移率族蛋白 1(HMGB1)可能作為新的“晚期”炎癥因子參與了內(nèi)毒素的致病過程，對(duì)ALI/ARDS的發(fā)生和發(fā)展起重要作用。本實(shí)驗(yàn)在建立大鼠LPS誘導(dǎo)膿毒癥肺損傷模型的基礎(chǔ)上，觀察肺組織HMGB1的表達(dá)，并采用血必凈干預(yù)，研究其對(duì)大鼠膿毒癥肺損傷的保護(hù)作用，探討可能的作用機(jī)制，為防治膿毒癥肺損傷開辟新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性Wistar大鼠45只，2.5～3.5 月齡，體質(zhì)量 250 ～280 g/只，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供［生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(滬)2008-0016］。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品和試劑 脂多糖(LPS，Escherichia coliO127:B8，L3129，Sigma，美國(guó));HMGB1 羊抗多克隆抗體(Santa Cruz，美國(guó));血必凈注射液(規(guī)格10ml/支，天津紅日藥業(yè)有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、模型建立及給藥方法 以10%水合氯醛5m l/kg腹腔注射將大鼠麻醉后固定，經(jīng)大鼠股靜脈按5 mg/kg注射LPS。45只SPF級(jí)雄性成年Wistar大鼠隨機(jī)分為三組:(1)健康對(duì)照組(n=15)、(2)脂多糖組(LPS 組，n=15)、血必凈干預(yù)組(XBJ組，n=15)。血必凈組在造模前半小時(shí)靜脈內(nèi)給予血必凈4ml/kg，健康對(duì)照組和LPS組則給予等容積0.9%氯化鈉注射溶液。在造模后6 h、12 h、24 h各隨機(jī)處死大鼠5只，分別作為I、Ⅱ、Ⅲ亞組，無菌留取大鼠肺組織。

1.3.2 標(biāo)本制備 在造模后6 h、12 h、24 h各隨機(jī)處死大鼠5只，分別作為I、II、Ⅲ亞組，取右肺上、下葉組織用4%多聚甲醛固定，制成病理切片，分別采用蘇木精-伊紅(H-E)染色及免疫組織化學(xué)染色。

1.3.3 免疫組織化學(xué)法(IHC)檢測(cè)肺組織中HMGB1蛋白表達(dá) 肺組織中HMGB1蛋白的檢測(cè)采用SP法。石蠟包埋肺組織作5μm厚度的切片常規(guī)脫蠟，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗，0.3%H2O2甲醇溶液消除內(nèi)源性過氧化物酶，胰蛋白酶修復(fù)后，正常羊血清封閉非特異性抗原，滴加1∶50的羊抗大鼠HMGB1多克隆抗體，2℃過夜。PBS漂洗后滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗羊二抗，37℃孵育30 min，PBS漂洗后二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木精復(fù)染，脫水、透明、封片。以Image pro Plus5.1圖像分析軟件對(duì)肺組織免疫組織化學(xué)結(jié)果進(jìn)行半定量分析，每張切片隨機(jī)選5個(gè)不重復(fù)的視野，放大400倍，計(jì)算機(jī)自動(dòng)測(cè)定并計(jì)算HMGB1陽性染色的積分光密度值(IOD)，分別取其平均值進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSSl3.0軟件包分析，所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組均數(shù)采用單因素方差分析(ONE-WAY ANOVA)，組間兩兩比較采用SNK法。

2 結(jié)果

2.1 肺組織的病理形態(tài)學(xué)變化 光鏡下，健康對(duì)照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡隔無水腫、無炎癥，肺泡腔清晰。且各時(shí)間點(diǎn)無明顯差異;LPS組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)基本消失，肺泡隔增寬，部分肺泡內(nèi)見滲出、水腫、出血，肺間質(zhì)見大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。且隨時(shí)間點(diǎn)增長(zhǎng)而明顯。XBJ組大鼠肺組織肺泡隔略有增寬，部分肺泡內(nèi)見滲出、水腫、出血，肺間質(zhì)見少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

2.2 肺組織HMGB1蛋白的表達(dá) 正常大鼠肺組織微弱陽性表達(dá)HMGB1，少量分布于肺泡和間質(zhì)上皮細(xì)胞、小支氣管黏膜上皮細(xì)胞。LPS組肺組織HMGB1強(qiáng)陽性表達(dá)，主要分布于肺泡上皮和間質(zhì)上皮細(xì)胞、小支氣管黏膜上皮細(xì)胞、肺泡和間質(zhì)中大量的炎性細(xì)胞。XBJ組肺組織HMGB1陽性表達(dá)減輕。圖像分析軟件測(cè)定的積分光密度值提示，LPS各亞組較健康對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，XBJ各亞組較LPS組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，見表1。

3 討論

既往認(rèn)為，早期促炎介質(zhì)(包括 TNF-α、IL-1等)是引起肺損傷時(shí)機(jī)體失控性炎性反應(yīng)與組織損害的關(guān)鍵介質(zhì)，然而過去十余年中，臨床采取TNF-α和IL-1拮抗劑治療并未取得滿意效果，提示可能存在晚期炎癥介質(zhì)參與病理反應(yīng)。近年研究表明，HMGB1是一種關(guān)鍵的晚期促炎介質(zhì)，在ALI/ARDS病程進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，使人們看到了肺損傷治療的新希望。HMGB1是一種核內(nèi)蛋白，最早被認(rèn)為是基因轉(zhuǎn)錄中一種重要的因子［3］。1999年，Wang等［2］首次報(bào)道HMGBl作為新的潛在的晚期炎癥介質(zhì)，參與了膿毒癥的發(fā)病過程，是內(nèi)毒素致死效應(yīng)的晚期重要炎癥介質(zhì)。HMGBl的致病作用的另一大特點(diǎn)是有維持和放大炎癥作用。感染因素或非感染因素均可引起細(xì)胞主動(dòng)或被動(dòng)釋放HMGB1［4］。通過晚期糖基化終末產(chǎn)物受體及TLR 4，2結(jié)合，HMGB1將信號(hào)傳入細(xì)胞外環(huán)境。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1可分泌到胞漿乃至胞外，與 IL-l、IL-6、TNF-α等重要炎癥因子相互誘生并可引起炎癥信號(hào)分子NF-κB的核移位。應(yīng)用抗HMGB1抗體進(jìn)行干預(yù)后，對(duì)嚴(yán)重內(nèi)毒素血癥、膿毒癥、關(guān)節(jié)炎以及內(nèi)毒素誘導(dǎo)的急性肺損傷均有積極的治療作用。這些觀察表明HMGB1是細(xì)胞損傷的關(guān)鍵介質(zhì)，因此抑制它可以改善臨床結(jié)果。

表1 三組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)肺組織HMGB1的免疫組織化學(xué)表達(dá)(IOD±s，×103)

表1 三組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)肺組織HMGB1的免疫組織化學(xué)表達(dá)(IOD±s，×103)

注:I、Ⅱ、Ⅲ亞組為6h、12h、24h各隨機(jī)處死大鼠5只所檢測(cè)結(jié)果;與對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)比較，a P＜0.05;與LPS組同時(shí)間點(diǎn)比較，b P ＜0.05

組別 鼠數(shù)(只) Ⅰ亞組(6h，n=5) Ⅱ亞組(12h，n=5) Ⅲ亞組(24h，n=5)對(duì)照組15 4.68 ±1.26 4.89 ±1.37 4.97 ±1.12 LPS 組 15 15.46 ±3.69a 27.21 ±4.35a 43.24 ±5.39a XBJ組 15 10.76 ±2.32ab 19.44 ±3.68ab 28.60 ±5.13ab

本實(shí)驗(yàn)采用大鼠股靜脈注射LPS復(fù)制膿毒癥肺損傷大鼠模型。免疫組織化學(xué)的研究結(jié)果顯示，正常大鼠肺組織呈微弱陽性表達(dá)HMGB1，少量分布于肺泡和間質(zhì)上皮細(xì)胞、小支氣管黏膜上皮細(xì)胞，各時(shí)間點(diǎn)未見明顯區(qū)別。LPS組肺組織HMGB1強(qiáng)陽性表達(dá)，主要分布于肺泡上皮和間質(zhì)上皮細(xì)胞、小支氣管黏膜上皮細(xì)胞，肺泡和間質(zhì)中大量的炎性細(xì)胞，呈棕黃色染色。12h時(shí)間點(diǎn)可見較強(qiáng)陽性表達(dá)，且以24h為最強(qiáng)。Kim等［5］在失血性休克引起的肺損傷動(dòng)物模型中也有同樣的發(fā)現(xiàn)。同時(shí)我們?cè)诠忡R下觀察到肺泡隔增寬，部分肺泡內(nèi)見滲出、水腫、出血，肺間質(zhì)見多量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等明顯肺損傷表現(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)肺組織HMGB1表達(dá)與肺組織的病理損害程度基本一致。這些均證實(shí)肺組織HMGB1誘生與內(nèi)毒素介導(dǎo)的急性肺損害關(guān)系密切。

以往的研究還表明HMGB1在損傷后相對(duì)晚期階段表達(dá)，這一發(fā)現(xiàn)與我們的觀察結(jié)果亦一致，即在LPS加入后12h肺組織HMGB1的水平明顯增加。因此提示HMGB1在LPS誘導(dǎo)的肺損傷炎癥及發(fā)展的過程中起著關(guān)鍵作用。

隨著對(duì)ALI發(fā)生機(jī)制研究的逐步深入，尋找能減少早期和晚期炎性介質(zhì)分泌的藥物日益引起人們的關(guān)注。血必凈是在古方血府逐瘀湯基礎(chǔ)上精煉出的復(fù)方中藥?kù)o脈制劑，由中藥赤芍、川芎、丹參、紅花、當(dāng)歸的提取物組成，具有很好活血化瘀、疏通絡(luò)脈、潰散毒邪的作用。

本研究結(jié)果顯示，應(yīng)用血必凈治療后各時(shí)間點(diǎn)肺組織HMGB1蛋白表達(dá)均顯著降低，同時(shí)肺組織病理形態(tài)學(xué)改變均有明顯改善，提示血必凈可有效降低肺組織HMGB1的表達(dá)，減少炎癥因子的釋放和炎性反應(yīng)的擴(kuò)大，減輕肺組織炎性反應(yīng)，對(duì)膿毒癥誘導(dǎo)的肺損傷具有一定治療作用。

目前針對(duì)于血必凈抗炎機(jī)制的多項(xiàng)基礎(chǔ)研究尚處于初級(jí)階段，許多問題還需進(jìn)行深入研究，其是否能夠作為危重病治療藥物有待進(jìn)一步評(píng)價(jià)。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)ALI的發(fā)病過程中可能出現(xiàn)了晚期炎癥因子HMGB1表達(dá)的上調(diào)，運(yùn)用血必凈治療膿毒癥ALI后能夠抑制大鼠肺組織HMGB1的表達(dá)水平，改善ALI時(shí)的炎性反應(yīng)，減少白細(xì)胞滲出，減輕肺水腫及肺組織病理損傷，對(duì)大鼠膿毒癥肺損傷有明顯保護(hù)作用，預(yù)示著血必凈具有良好的臨床應(yīng)用前景，可能會(huì)給膿毒癥的治療帶來希望。

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