宣柳，李筱青，盛曉蓉

(安徽省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院，合肥230016)

CD4+CD25+Fox p3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)是近年來發(fā)現(xiàn)的不同于Th1和Th2的細(xì)胞，其數(shù)量和功能的改變對調(diào)控機(jī)體的免疫應(yīng)答具有重要的作用。有研究顯示［1-2］:Treg對多種刺激呈低反應(yīng)狀態(tài)，并能抑制CD4+和CD8+T活化和增殖，與多種疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān);但有關(guān)Treg如何調(diào)節(jié)T輔助淋巴細(xì)胞(Th1/Th2)細(xì)胞因子，以及在乙型肝炎慢性化中所起作用的研究鮮有報(bào)道。本研究采用ELISA和流式細(xì)胞術(shù)分別對乙型肝炎患者(CHB)、正常人群外周血檢測Th1/Th2細(xì)胞因子和Treg分布頻率，從細(xì)胞免疫方面探討乙型肝炎的慢性化機(jī)制。

1 對象和方法

1.1 對象 20例CHB為安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院2010年2月至2010年7月收治并臨床確診的病例，符合2005年中華醫(yī)學(xué)會(huì)、感染病學(xué)分會(huì)《慢性乙型肝炎防治指南》診斷標(biāo)準(zhǔn)［3］;所有病例均排除合并其他肝炎病毒感染、自身免疫性、乙醇性肝病以及重癥肝病等患者，未經(jīng)任何免疫抑制劑治療;并選20例性別和年齡相同的健康體檢者作為研究對照。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器和試劑 流式細(xì)胞儀型號:Benkman Coulter 3XL(美國產(chǎn));Fox P3-FITC、CD25-PE-Cy5、CD4-PE、pH7.2-7.4 磷酸鹽緩沖液和紅細(xì)胞裂解液均購自美國BD公司。

1.3 檢測方法 用于測定細(xì)胞因子的血清凍存于－30℃，γ 干擾素(IFN-γ)、白細(xì)胞介素(IL)-2、IL-4和IL-10的測定采用ELISA方法，每樣本均檢測雙孔取均值，試劑盒系美國Genzyme公司產(chǎn)品，由深圳晶美生物工程公司分裝。上述實(shí)驗(yàn)均按說明書程序操作。用流式細(xì)胞儀檢測 CD4+CD25+Fox p3+Treg，取新鮮采集的 EDTA抗凝血1 ml，2 h內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞表型分析。取抗凝血100μl，各加入10μl CD4-PE、CD25-PE-Cy5，再加入1m l經(jīng)過稀釋的固定、透膜劑，反應(yīng)30min后，以透膜緩沖稀釋液洗滌并重懸，再加入10μl FITC標(biāo)記的抗人FoxP3抗體，反應(yīng)30 min后洗滌，以400μl冷PBS重懸，測定。

表1 兩組血清細(xì)胞因子的比較( ± s，ng/L)

表1 兩組血清細(xì)胞因子的比較( ± s，ng/L)

注:與健康對照組比較，a P＜0.05

IL-2 IL-4 IL-10健康對照組 20 31.61 ±14.35 49.02 ±18.33 9.89 ±5.34 24.77 ±組別 例數(shù) IFN-γ 11.96慢性乙型肝炎組 20 35.64 ±15.31 35.53 ±14.23a 16.63 ±6.61a 38.53 ±14.46a

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞因子檢測 與健康對照組相比，CHB組的IL-2明顯減低(P＜0.05)，IL-4和IL-10均明顯增高(P ＜0.05)，見表1。

2.2 外周血 Treg水平 CHB患者組Treg細(xì)胞占CD4+T淋巴細(xì)胞的百分比［(5.72±0.94)%］明顯高于健康對照組［(4.60 ±0.66)%］，P ＜0.05。

3 討論

叉頭翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子(Fox p3)在調(diào)控Treg的發(fā)育上起著重要作用。研究證明［4-5］，F(xiàn)ox p3在Treg特異性表達(dá)，并與它的分化發(fā)育和功能成熟密切相關(guān)，這在一定程度上可反映Treg的水平和功能活性。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CHB外周血Treg占CD4+細(xì)胞的5.72%左右，明顯高于健康對照組，這與Stoop 等報(bào)道一致［2］。

據(jù)所產(chǎn)生細(xì)胞因子的功能不同，輔助性T淋巴細(xì)胞(Th)可分為Th1和Th2細(xì)胞。Th1細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ、IL-2等細(xì)胞因子，主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答。Th2細(xì)胞產(chǎn)生IL-4、IL-10和IL-13等，主要功能為促進(jìn)B淋巴細(xì)胞發(fā)育和介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答。一般認(rèn)為，Th1免疫應(yīng)答增強(qiáng)宿主對微生物感染;而Th2應(yīng)答則與感染的進(jìn)展、持續(xù)性和慢性化有關(guān)［6］。本研究顯示:慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染者的IL-2水平明顯低于健康對照組，而IL-4、IL-10明顯高于健康對照組。因而認(rèn)為，一方面由于病毒感染，Th1/Th2細(xì)胞在體內(nèi)均被激活，血液中細(xì)胞因子水平有升高的趨勢，但另一方面Treg能抑制Th1/Th2細(xì)胞的活化和增殖，且Treg對Th1的抑制作用明顯強(qiáng)于Th2。

總之，在CHB組中，Treg分布頻率較高，使得CHB的Th2的應(yīng)答增強(qiáng)，可能是HBV感染慢性化的作用機(jī)制之一。這反映出宿主的一種自身保護(hù)機(jī)制，即人體試圖通過調(diào)節(jié)降低免疫/炎性反應(yīng)，來減弱乙型肝炎的炎癥過程，從而減輕肝細(xì)胞損傷，同時(shí)也使宿主不能有效清除HBV，導(dǎo)致感染的慢性化。

［1］ Franzes O，Kennedy PT，Gehring AJ，et al.Modulation of the CD8+T-cell response by CD4+CD25+regulatory T cells in patients with hepatitis B virus infection［J］.J Virol，2005，79(6):3322-3328.

［2］ Stoop JN ，vander Molen RG ，Baan CC ，et al.Regulatory T cells contribute to the impaired immune response in patients with chronic hepatitis B virus infection［J］.Hepatology，2005，41(4):771-778.

［3］ 中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)，中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì).慢性乙型肝炎防治指南［J］.中華內(nèi)科雜志，2006，45(2):162-170.

［4］ Hori S，Nomura T，Sakaguchi S，etal.Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3［J］.Science，2003，299(5609):1057-1061.

［5］ Ramsdell F ，Ziegler SF.Transcription factors in autoimmunity［J］.Curr Opinin Immunol，2003，15(6):718-724.

［6］ Modlin RL，Nutman TB.Type 2 cytokines and negative immune regulation in human infections［J］.Curr Opin Immunol，1993，5(4):511-514.