秦杰，陳瑾，黃守國

·生物診斷技術(shù)·

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測WISP-1/NGX6基因體系與子宮頸癌細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移的關(guān)系

秦杰，陳瑾，黃守國

目的探討原癌基因 WISP-1 和抑癌基因 NGX6 與子宮頸癌細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

宮頸腫瘤； 原癌基因； 基因表達(dá)

www.cmbp.net.cn 中國醫(yī)藥生物技術(shù), 2011, 6(6):410-414

子宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，是女性患者的主要死亡原因之一。近年來子宮頸癌的防治已取得較大的進(jìn)展，子宮頸癌的發(fā)病率亦明顯下降，但年輕婦女子宮頸癌的發(fā)病率則呈明顯上升趨勢，并由此引起國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，而尋找子宮頸癌早期診斷的基因指標(biāo)及有效治療子宮頸癌的方法，進(jìn)一步明確子宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的分子生物學(xué)以及基因表達(dá)機(jī)制也已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。雖然目前已有常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法如免疫組化等從組織學(xué)角度對子宮頸癌在蛋白質(zhì)分子水平進(jìn)行了分析研究，但有關(guān)基因水平的研究報(bào)道甚少，尤其是原癌基因 WISP-1/抑癌基因 NGX6 體系在子宮頸癌組織中的表達(dá)，國內(nèi)外至今尚未見報(bào)道。

鑒于此，為了研究 WISP-1/NGX6 基因體系與子宮頸癌細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移的關(guān)系，了解其在子宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展過程中的表達(dá)規(guī)律，本研究利用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR技術(shù)對子宮頸癌轉(zhuǎn)移組、未轉(zhuǎn)移組及正常子宮頸組織標(biāo)本中該基因體系的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測，并對比分析了 3 組標(biāo)本中該基因體系的表達(dá)量，以期為進(jìn)一步有效預(yù)防和治療子宮頸癌提供有利依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1標(biāo)本來源 90 例標(biāo)本均取自中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬海口醫(yī)院婦科手術(shù)切除標(biāo)本，患者年齡 25 ～ 65（47.38 ± 12.35）歲。入選標(biāo)本均以病理診斷為標(biāo)準(zhǔn)，其中正常子宮頸組織標(biāo)本（病理診斷為慢性宮頸炎或非癌變組織）30 例，子宮頸浸潤癌（子宮頸鱗狀細(xì)胞癌）60 例，而子宮頸浸潤癌又分為轉(zhuǎn)移組和未轉(zhuǎn)移組各 30 例。所有病例術(shù)前均未經(jīng)化療、放療、生物治療等其他治療，并排除其他系統(tǒng)合并癥及其他系統(tǒng)腫瘤等疾病。標(biāo)本離體后立即取材，–80 ℃ 冰箱保存。

1.1.2儀器與試劑 MJ Opticon2 熒光定量 PCR儀為美國 BIO-RAD 公司產(chǎn)品；Taq 酶（貨號(hào)DR001A）購自日本 TaKaRa 公司；Rever Tra Ace-α-反轉(zhuǎn)錄試劑盒（FSK-100）購自日本 Toyobo 公司；其余常規(guī)化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1引物與探針的設(shè)計(jì)與合成 參考人WISP-1、NGX6 基因 mRNA 序列（GenBank：NM-080838、NM-001042590），利用 Primer express2.0 軟件分別設(shè)計(jì)針對WISP-1、NGX6 及內(nèi)參照β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）的引物（P1 ～ P6）與探針，并分別在探針的 5′ 端引入 FAM 羧基熒光素，3′ 端引入熒光淬滅基團(tuán)，其序列見表 1。引物和探針均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.2人子宮頸（癌）組織總 RNA 的提取 自超低溫冰箱中取出人子宮頸（癌）組織標(biāo)本，迅速用剪刀剪下約 0.25 g 樣品，置于預(yù)先加入 200 μl RNAiso? Plus 的 1.5 ml EP 管中。在 RNAiso?Plus 溶液中破碎人子宮頸（癌）組織，補(bǔ)充 800 μl RNAiso? Plus 后混勻。冰上靜置 5 min，再加入200 μl 氯仿，旋緊后劇烈振蕩 15 s（氯仿沸點(diǎn)低、易揮發(fā)，振蕩時(shí)應(yīng)小心離心管蓋突然彈開）。待溶液充分乳化后，在冰上靜置 5 min。4 ℃、13800 ×g高速離心 15 min 后，將上層水相移至新管中，然后加入等體積的異丙醇，冰上放置 10 min，4 ℃、13800 ×g離心 10 min。棄上清，以 1 ml 75％ 乙醇[焦碳酸二乙酯（DEPC）水配制]洗滌沉淀，反復(fù)顛倒數(shù)次，4 ℃、13800 ×g離心 5 min。棄上清，空氣干燥 RNA 10 min，加入 20 μl DEPC 水溶解，立即取 2 μl RNA 溶液進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，剩余 18 μl RNA 溶液 –80 ℃ 凍存。

1.2.3反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) RNA熱變性：反應(yīng)體系總體積為 12 μl，其中包括 25 pmol/μl 隨機(jī)引物1 μl、DEPC 水 9 μl、RNA 2 μl；65 ℃ 水浴5 min 后迅速在冰上冷卻 2 min，離心收集反應(yīng)液。配制總體積為 20 μl 的反應(yīng)體系，其中包括第一步變性后的 RNA 溶液 12 μl、5 × RT Buffer 4 μl、dNTP 混合物（各 10 mmol/L）2 μl，RNase抑制劑（10 U/μl）1 μl，Rever Tra Ace 1 μl；RT反應(yīng)條件為：30 ℃ 10 min，42 ℃ 20 min，99 ℃ 5 min，4 ℃ 5 min。

1.2.4RT-PCR 反應(yīng) 配制總體積為 25 μl 的反應(yīng)體系，其中包括 10 × PCR Buffer 2.5 μl、2.5 mmol/L dNTP 2 μl、dH2O 16 μl、15 pmol/μl 引物 2 μl、15 pmol/μl 探針 0.3 μl、5 U/μlTaq酶0.2 μl、反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物 cDNA 2 μl。PCR Buffer成分：100 mmol/L Tris-HCl（pH 8.3）、500 mmol/L KCl、15 mmol/L MgCl2。加樣至 96孔定量 PCR 反應(yīng)孔中，每個(gè)樣品同時(shí)設(shè) 3 孔，用于檢測同一個(gè)指標(biāo)基因的樣本統(tǒng)一上機(jī)。在 MJ Opticon2 熒光定量PCR 儀上擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：94 ℃ 2 min；94 ℃5 s，55 ℃ 30 s，共 40 個(gè)循環(huán)，讀取 FAM 熒光數(shù)值；30 ℃ 5 s。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用 SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料基因表達(dá)量均采取隨機(jī)獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 WISP-1 基因表達(dá)量的比較

采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR方法分別檢測子宮頸癌組織轉(zhuǎn)移組與未轉(zhuǎn)移組、正常子宮頸組織中WISP-1 基因的表達(dá)量，結(jié)果表明原癌基因WISP-1在子宮頸癌組織未轉(zhuǎn)移組中表達(dá)量明顯高于正常子宮頸組織（P= 0.000、P＜ 0.001）；在子宮頸癌組織轉(zhuǎn)移組中表達(dá)量明顯高于未轉(zhuǎn)移組（P= 0.000、P＜ 0.001）；在子宮頸癌組織轉(zhuǎn)移組中表達(dá)量明顯高于正常子宮頸組織（F= 44.770，t= –5.638，P= 0.000、P＜ 0.001）（表 2）。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR引物與探針序列Table 1 Sequences of primers and probes for real-time fluorescence quantitative PCR

表2 WISP-1 基因在子宮頸（癌）組織中的表達(dá)Table 2 The expression of WISP-1 gene in thecervical (cancer) tissues

2.2 NGX6 基因表達(dá)量的比較

采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR方法分別檢測子宮頸癌組織轉(zhuǎn)移組與未轉(zhuǎn)移組、正常子宮頸組織中NGX6 基因的表達(dá)量，結(jié)果表明抑癌基因NGX6在子宮頸癌組織未轉(zhuǎn)移組中表達(dá)量明顯低于正常子宮頸組織（P= 0.000、P＜ 0.001）；在子宮頸癌組織轉(zhuǎn)移組中表達(dá)量明顯低于未轉(zhuǎn)移組（P= 0.001、P＜ 0.05）；在子宮頸癌組織轉(zhuǎn)移組中表達(dá)量明顯低于正常子宮頸組織（F= 20.760，t= 6.024，P= 0.000、P＜ 0.001）（表 3）。

表3 NGX6 基因在子宮頸（癌）組織中的表達(dá)Table 3 The expression of NGX6 gene in the cervical (cancer) tissues

3 討論

腫瘤的惡變過程包括細(xì)胞增殖、DNA 過度復(fù)制、細(xì)胞周期功能紊亂、細(xì)胞永生化、逃逸凋亡、血管增生及轉(zhuǎn)移浸潤等一系列過程，相應(yīng)的分子機(jī)制主要有原癌基因的激活、抑制癌基因失活等[1]。原癌基因是指一大類可促進(jìn)細(xì)胞分裂并有潛在致癌或促癌作用的基因群；抑癌基因或抗癌基因則是一大類可抑制細(xì)胞生長并有潛在抑制癌變作用的基因群。原癌基因的激活與抑癌基因的失活，使細(xì)胞生長與分化的調(diào)節(jié)失控，導(dǎo)致細(xì)胞持續(xù)分裂和癌變。當(dāng)抑癌基因失活后，可能使原癌基因充分發(fā)揮它的作用而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，但某一種原癌基因與抑癌基因?qū)?xì)胞分裂的正負(fù)調(diào)控作用，僅僅局限在某一種特定細(xì)胞的范疇內(nèi)有效[2]。正是基于這一認(rèn)識(shí)，目前關(guān)于腫瘤細(xì)胞增殖的研究正迅速開展，以期在基因水平揭示腫瘤增殖轉(zhuǎn)移的本質(zhì)，為改進(jìn)腫瘤的診斷方法和治療手段提供依據(jù)。因此，本研究選用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對子宮頸癌及正常子宮頸組織標(biāo)本中WISP-1/NGX6 基因體系的表達(dá)量進(jìn)行了對比分析，以探討WISP-1/NGX6 基因體系對子宮頸癌細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移的影響。

WISP-1 基因是在對大鼠高轉(zhuǎn)移性和低轉(zhuǎn)移性黑色素細(xì)胞突變體進(jìn)行 RNA 差異篩選時(shí)被發(fā)現(xiàn)存在于低轉(zhuǎn)移性黑色素細(xì)胞中[3]。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，WISP-1 基因定位于人染色體 8q24.1 ～ 8q24.3[4]，其轉(zhuǎn)錄的原始 mRNA 有 5 個(gè)外顯子，經(jīng)剪切加工成2 種轉(zhuǎn)錄變異體，是一種富含半胱氨酸且長度為367 個(gè)氨基酸的分泌性蛋白多肽。采用 PCR 測定人多種組織樣本中WISP-1 基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其存在于多種組織器官，如成人心臟、腎臟、肺、胰腺、胎盤、卵巢、小腸、脾，而在腦、肝臟、骨骼肌、結(jié)腸、外周血白細(xì)胞、前列腺、睪丸和胸腺中，WISP-1 基因低表達(dá)或不表達(dá)[5]。WISP-1 基因的生物學(xué)功能包括促進(jìn)細(xì)胞增殖、介導(dǎo)細(xì)胞黏附、促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)增長、刺激細(xì)胞轉(zhuǎn)移等生物學(xué)功能，同時(shí)也可調(diào)節(jié)較復(fù)雜的生物學(xué)過程，參與血管形成和腫瘤形成[6]。WISP-1 是 Wnt-1-β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路的下游靶基因，β-連環(huán)蛋白是 Wnt 信號(hào)通路的關(guān)鍵成分，可以與 Wnt 信號(hào)通路中的其他成分相結(jié)合，它在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的水平改變還可影響某些基因的表達(dá)；在細(xì)胞質(zhì)中突變的 β-連環(huán)蛋白將與 DNA 結(jié)合因子相互作用，進(jìn)而激活下游基因，引起一系列的改變，促進(jìn)腫瘤形成；而WISP-1 作為該通路的下游靶基因，自然與腫瘤的形成緊密相關(guān)[7-10]。

本研究發(fā)現(xiàn)，子宮頸癌組織轉(zhuǎn)移組與未轉(zhuǎn)移組中WISP-1 基因的表達(dá)量均高于正常子宮頸組織，且子宮頸癌組織轉(zhuǎn)移組中該基因的表達(dá)量明顯高于未轉(zhuǎn)移組，由此說明WISP-1 基因與子宮頸癌細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移成正相關(guān)，即該基因可促進(jìn)子宮頸癌的形成，對癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移亦有促進(jìn)作用，但具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

NGX6 基因是中南大學(xué)腫瘤研究所分子遺傳室采用定位候選克隆策略克隆而成的一個(gè)鼻咽癌候選抑瘤基因（基因登陸號(hào)：AFl88239），其定位于染色體 9P21 ～ 22 區(qū)。而 9P21 ～ 22 區(qū)域的等位基因雜合性丟失現(xiàn)象是人類多種腫瘤組織中的共同事件，這提示NGX6 基因可能為腫瘤相關(guān)基因[11]。生物信息學(xué)分析表明該基因 cDNA 全長2.1 kb，編碼 1 個(gè)含 338 個(gè)氨基酸的跨膜蛋白，其具有 2 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)（234 ～ 256、269 ～ 291），胞外區(qū)含有 1 個(gè) EGF-like domain（185 ～ 221）、3 個(gè)N-糖基化位點(diǎn)（92 ～ 95、100 ～ 103、172 ～ 175）；胞內(nèi)區(qū)較短，含有 1 個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)（257 ～ 268），提示 NGX6 基因可能編碼 1 種跨膜蛋白，并通過其酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)、N-糖基化位點(diǎn)等功能域調(diào)控細(xì)胞的增殖、黏附和運(yùn)動(dòng)等生物學(xué)過程[12]。同時(shí)，有研究已經(jīng)證實(shí) NGX6 基因在結(jié)腸癌，尤其在伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌組織中表達(dá)明顯下降甚至缺失[13]。另外，有實(shí)驗(yàn)已初步證實(shí)NGX6 基因可對 Wnt-1-β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路進(jìn)行負(fù)調(diào)控，并推測 β-連環(huán)蛋白可能即為 NGX6 的作用靶點(diǎn)[14]。

本研究發(fā)現(xiàn)，NGX6 基因在子宮頸癌組織轉(zhuǎn)移組及未轉(zhuǎn)移組中表達(dá)量均低于正常子宮頸組織，且子宮頸癌組織轉(zhuǎn)移組中該基因表達(dá)量明顯低于未轉(zhuǎn)移組，由此說明 NGX6 基因表達(dá)量的降低與子宮頸癌的發(fā)生相關(guān)，亦與子宮頸癌的轉(zhuǎn)移相關(guān)。

綜上，本研究結(jié)果表明，原癌基因 WISP-1 在子宮頸癌組織轉(zhuǎn)移組及未轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)量均明顯高于正常子宮頸組織，在子宮頸癌組織轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)量明顯高于未轉(zhuǎn)移組；抑癌基因 NGX6 在子宮頸癌組織轉(zhuǎn)移組及未轉(zhuǎn)移組中表達(dá)量均低于正常子宮頸組織，在子宮頸癌組織轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)量明顯低于未轉(zhuǎn)移組，即提示 WISP-1/NGX6 基因體系表達(dá)異常與子宮頸癌的發(fā)生有關(guān)，并且其作用均與 Wnt 信號(hào)通路有關(guān)。但本實(shí)驗(yàn)標(biāo)本局限于新鮮組織，要求術(shù)后 30 min 內(nèi)立即取材保存，子宮頸癌患者取材對病理報(bào)告結(jié)果具有一定不良影響，因此實(shí)驗(yàn)標(biāo)本數(shù)量偏少。此外，本實(shí)驗(yàn)僅對 WISP-1 和 NGX6 基因的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測及詳細(xì)分析，而對于其基因功能未進(jìn)行具體研究，因此關(guān)于WISP-1/NGX6 基因體系可否作為子宮頸癌早期診斷與監(jiān)測的基因指標(biāo)，其是否參與子宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展等問題尚有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

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Correlation betw een WISP-1/NGX6 gene expr ession and cervical cancer cell pr oliferation and/or metastasis analyzed by real-time fluorescence quantitative PCR

QIN Jie, CHEN Jin, HUANG Shou-guo

ObjectiveTo explore the correlation between oncogene WISP-1 and tumor-suppressor gene NGX6 expression and cervical cancer cell proliferation and/or metastasis.MethodsPrimers and probes were designed and synthesizes based on the mRNA sequence of human WISP-1 and NGX6 gene, respectively. Total RNA were extracted from human normal cervixtissues (30 cases) as well as non-metastasis and metastasis group (30 cases for each group) of cervix invasive cancer (cervical squamous cell carcinoma) tissues, and the expressions of WISP-1 and NGX6 gene were detected and compared by real-time quantitative fluorescence PCR.ResultsThe expression of the oncogene WISP-1 in both metastasis and non-metastasis group of cervical cancer tissues were significantly higher than normal cervical tissues (with P ＜ 0.001 for both). Moreover, WISP-1 gene expression in the metastasis group was significantly higher when compared to the non-metastasis group of cervical cancer tissues (P ＜ 0.001). The expression of tumor-suppressor gene NGX6 in both metastasis group and non-metastasis group of cervical cancer tissues were lower than normal cervical tissues (with P ＜ 0.001 for both). Similarly, NGX6 gene expression in the metastasis group was significantly lower when compared to the non-metastasis group of cervical cancer tissues (P ＜ 0.05).ConclusionWISP-1/NGX6 gene expression has correlation with cervical cancer cells proliferation and metastasis.

Uterina cervical neoplasms; Proto-oncogenes; Gene expression

HUANG Shou-guo, Email: shouguohuang@126.com

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2011.06.003

海南省自然科學(xué)基金（2011-SZR-01-093）

570208 海口，中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬海口醫(yī)院婦產(chǎn)科

黃守國，Email：shouguohuang@126.com

2011-10-14

方法參考人 WISP-1、NGX6 基因 mRNA 序列分別設(shè)計(jì)引物與探針。提取人正常子宮頸組織（30 例）、子宮頸浸潤癌（均為子宮頸鱗狀細(xì)胞癌）組織未轉(zhuǎn)移組及轉(zhuǎn)移組（各30 例）總 RNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)分別檢測各組標(biāo)本組織中 WISP-1、NGX6 基因的表達(dá)量并進(jìn)行對比分析。

結(jié)果原癌基因 WISP-1 在子宮頸癌組織轉(zhuǎn)移組及未轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)量均明顯高于正常子宮頸組織（均 P ＜ 0.001），在子宮頸癌組織轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)量明顯高于未轉(zhuǎn)移組（P ＜0.001）。抑癌基因 NGX6 在子宮頸癌組織轉(zhuǎn)移組及未轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)量均低于正常子宮頸組織（均 P ＜ 0.001），在子宮頸癌組織轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)量明顯低于未轉(zhuǎn)移組（P ＜0.05）。

結(jié)論WISP-1/NGX6 基因體系與子宮頸癌的細(xì)胞增殖有關(guān)，并且與子宮頸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移亦有相關(guān)性。

Author Affiliation:Department of Gynecology and Obstetrics, Affiliated Haikou Hospital, Xiangya Medical College of Central South University, Haikou 570208, China

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2011, 6(6):410-414