梁權(quán)，羅春貞，毛培菊，王縵

·生物診斷技術(shù)·

HIV-1 gp41蛋白的表達(dá)及其免疫反應(yīng)性

梁權(quán)，羅春貞，毛培菊，王縵

目的高效表達(dá) HIV-1 gp41 基因片段，滿足生產(chǎn) HIV 體外檢測試劑的需要。

HIV-1； 蛋白質(zhì)類； 免疫活性

www.cmbp.net.cn 中國醫(yī)藥生物技術(shù), 2011, 6(6):415-419

HIV 在我國的流行形勢日趨嚴(yán)峻，全國首次HIV 分子流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)有 A、B（歐美 B）、B′（泰國 B）、C、D、E 和 F 7 種亞型，其中 B（占 47％）、C（占 34％）是主要流行亞型。第 2 次全國 HIV 流行病學(xué)調(diào)查顯示有 A、B、B′、C、D、E、F 和 G 8 種亞型及 2 個流行重組型 BC 和AE，其中 B′ 亞型（29％）、重組型 BC（50％）和重組型AE（15％）是主要流行亞型[1]。

由于 HIV 病毒的高度變異性，針對各亞型gp41 蛋白表位的特異性抗體有一定差異，使用HIV 抗體檢測試劑盒檢測患者血清中的 HIV-1 gp41 抗體會出現(xiàn)假陰性結(jié)果。如研究顯示，目前所用的幾種抗體檢測試劑盒檢測 A 亞型 HIV 病毒感染者血清敏感性較低。因此，加強對 HIV-1 各亞型 gp41 蛋白表位的比較研究對提高現(xiàn)有檢測試劑盒的免疫反應(yīng)性具有重要意義。

在前期工作中，我們表達(dá)了幾種我國 HIV-1主要流行亞型的 gp41 蛋白，對這些蛋白進行免疫反應(yīng)性和特異性的測定，根據(jù)測定結(jié)果對 gp41 基因表位進行篩選和整合[2-5]，優(yōu)化出一條含多亞型表位的 gp41 基因片段。本實驗在前期工作的基礎(chǔ)上，將 gp41 基因片段的 N 端引入一段融合基因，通過大腸桿菌原核表達(dá)方式獲得溶解性較好、特異性和免疫反應(yīng)性均較高的重組蛋白，為 HIV 體外血清學(xué)診斷提供原料，也為進一步研究 HIV-1 gp41蛋白表位的功能打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1質(zhì)粒和菌種 含部分心肌鈣蛋白（cTnI）基因的表達(dá)質(zhì)粒 E1 由本公司構(gòu)建并保存；宿主細(xì)胞DH5α、BL21DE3 由本公司保存；含優(yōu)化的 HIV-1 gp41 基因質(zhì)粒 X1 由本公司前期構(gòu)建并保存。

1.1.2主要試劑 國家藥品生物制品檢定所 HIV參考血清（批號：20081201）由本公司保存；HIV 抗體測定反應(yīng)板 HIV plate 由本公司生產(chǎn)并保存；1000 份 HIV 確證陰性血清由本公司保存；含部分cTnI 基因（與 E1 質(zhì)粒中 cTnI 基因相同）與HIV-2 gp36 基因的重組蛋白 CP1 由公司制備并保存；HIV-1 gp41 蛋白 X1 由公司制備并保存；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記鼠抗人二抗 IgG-HRP由本公司制備并保存；HIV-1 陽性血清、HIV-2 gp36單抗（monoclonal antibody，McAb）CN2、HIV-1 gp41 McAb GP47 由公司制備并保存。

1.2 方法

1.2.1引物設(shè)計 根據(jù) X1 基因序列相關(guān)資料，設(shè)計一對 PCR 引物，上游引物 P1：5′ GCGGGATC CGCAGTGGGAATAGGAGCTTTG 3′，下游引物P2：5′ GCGCTCGAGCAATAATTCTTGTTCATTCT T 3′。擴增 gp41 基因片段的上游引物引入 BamH I酶切位點，下游引物中引入 Xho I 位點。

1.2.2基因擴增及純化 以 X1 質(zhì)粒為模板，加入相應(yīng)的引物、DNTP、LA Tag 聚合酶進行 PCR擴增，反應(yīng)條件為 94 ℃ 40 s，60 ℃ 40 s，72 ℃1 min，共 30 個循環(huán)。使用生工生物工程（上海）有限公司 UNIQ-10 柱式 PCR 產(chǎn)物純化試劑盒純化 PCR 產(chǎn)物。

1.2.3表達(dá)載體構(gòu)建 純化后的各 PCR 產(chǎn)物經(jīng)BamH I 和 Xho I 酶切后，2％ 瓊脂糖凝膠電泳分離目的片段，使用生工生物工程（上海）有限公司UNIQ-10 柱式 DNA 膠回收試劑盒純化回收，連入表達(dá)載體 E1，構(gòu)建克隆質(zhì)粒 E1-1，將其轉(zhuǎn)化入DH5α 細(xì)胞中，篩選陽性克隆，使用生工生物工程（上海）有限公司 UNIQ-10 柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒提取陽性克隆質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)化至 BL21DE3中。

1.2.4重組蛋白的表達(dá)與純化 將含有重組質(zhì)粒的 BL21DE3 菌株接種于含有氨芐青霉素鈉（50 μg/ml）的 8 ml LB 培養(yǎng)基中，37 ℃ 培養(yǎng)過夜；次日，按 1∶100 擴大培養(yǎng)至A600 = 1.0 時，加入 IPTG 至終濃度為 1 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng) 3 h。收獲細(xì)菌，菌體懸浮于 PBS 中（140 mmol/L NaCl，10 mmo1/L Na2HPO4·12H2O，1.8 mmol/L KH2PO4，2.7 mmol/L KCl，pH 7.5），冰浴下超聲破菌，取少量上清和沉淀進行 12％ SDS-PAGE 電泳。收取超聲后的上清，按 Qiagen 公司的 Ni-NTA Agaros 純化步驟進行表達(dá)蛋白的純化。

1.2.5重組蛋白包被活性檢測 間接 ELISA 方法檢測活性，取上述 1.2.4 步驟純化后的重組蛋白用 PBS 稀釋至終濃度為 0.5 μg/ml，包被微孔反應(yīng)板，包被量為 100 μl/孔，取 CP1 和 X1 蛋白按相同條件包被作為陰性和陽性對照，包被板置 4 ℃過夜，次日加入 5％ 脫脂奶粉 200 μl/孔，置 37 ℃封閉 2 h，檢測的一抗為 HIV-1 陽性血清、CN2 McAb、TP47 McAb、HIV 陰性血清（單抗稀釋度為 l∶5000），二抗為 IgG-HRP，吸光度（A）由酶標(biāo)儀在 630 nm 和 450 nm 雙波長下測定。

1.2.6重組蛋白接酶活性檢測 將重組蛋白E1-1 用 PBS 稀釋至終濃度為 5 mg/ml，標(biāo)記HRP[6]，配套 HIV plate 雙抗原夾心法檢測 1000 份HIV 陰性血清和國家藥品生物制品檢定所 HIV參考血清。

1.2.7血站臨床實驗 按上述 1.2.6 步驟，生產(chǎn)配套 HIV ELISA 檢測試劑，以此作為考核試劑，以國外某公司生產(chǎn)的人類免疫缺陷病毒抗體（HIV1 + 2）及抗原（HIV1p24）聯(lián)合檢測試劑盒作為參比試劑，檢測 8085 份確證陰性血樣。

2 結(jié)果

2.1 gp41 基因 PCR 擴增及重組子鑒定

使用引物 P1、P2 進行 PCR 擴增的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，可見擴增產(chǎn)物約 450 bp 的DNA 片段（圖1），大小與預(yù)期設(shè)計相同。重組質(zhì)粒經(jīng) BamH I 和 Xho I 雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳分析顯示重組質(zhì)粒被切成大小約 5900 bp 的表達(dá)載體 E1 和 450 bp 的 gp41 截短基因（圖1），與預(yù)期一致。

圖1 gp41 片段瓊脂糖凝膠電泳鑒定Figure l Identification of gp41 gene fragment by agarose gel electrophoresis

2.2 重組菌的表達(dá)鑒定及純化

E1-1 重組菌裂解產(chǎn)物進行 SDS-PAGE 電泳分析，顯示誘導(dǎo)的重組菌裂解產(chǎn)物在大小約 37 kD的位置出現(xiàn)一條高濃度的 gp4l 融合蛋白區(qū)帶（圖2），與預(yù)期大小一致，經(jīng)可見光掃描分析，表達(dá)產(chǎn)物占菌體總蛋白量約 29.5％。

SDS-PAGE 電泳顯示大部分目的蛋白存在于裂解上清，經(jīng) Ni-NTA Agaros 純化，僅有少量蛋白質(zhì)殘留在穿過液中，大部分目的蛋白被純化基質(zhì)特異性吸附，經(jīng)洗滌液清洗后，大部分目的蛋白由洗脫液洗出，經(jīng)可見光掃描分析，目的蛋白純度約為95.1％。

2.3 重組蛋白包被活性鑒定

間接 ELISA 方法檢測各一抗標(biāo)本，如表 1 所示，重組蛋白 E1-1 與 HIV-1 陽性血清反應(yīng)、與TP47 McAb 反應(yīng)、與 HIV 陰性血清無明顯反應(yīng)，檢測結(jié)果與陽性對照板一致。

2.4 重組蛋白接 HRP 敏感性和特異性鑒定

1000 份 HIV 陰性血清檢測結(jié)果顯示有 1 份血清A值為 0.303，呈假陽性反應(yīng)，其余血清均為陰性反應(yīng)，特異性為 99.9％。HIV 參考血清中有HIV-1 型陽性血清 18 份（P1-P18），陰性血清20 份（N1-N20），靈敏度血清（S1-S6），如表 2 所示，檢測陽性血清A值均較高，檢測陰性血清有1 份呈假陽性（N18）。

圖2 SDS-PAGE 鑒定重組蛋白的表達(dá)及其純化Figure 2 SDS-PAGE analysis of the recombinant protein expressed in E.coli and purified by Ni-NTA

2.5 臨床實驗

以參考試劑為標(biāo)準(zhǔn)，考核試劑的陰性符合率為100％（8080/8080），其中 5 例不一致樣本考核試劑檢測為陰性，參比試劑檢測為陽性，這 5 例樣本經(jīng)確認(rèn)后，均為陰性。最終考評結(jié)果，考核試劑的陰性符合率為 100％（8085/8085），參考試劑陰性符合率為 99.9％（8080/8085）。

3 討論

當(dāng)前，國內(nèi) HIV 體外診斷試劑產(chǎn)品質(zhì)量有了很大提高，但與國外同類試劑相比假陽性率高、漏檢現(xiàn)象較多，究其原因主要是原料蛋白的質(zhì)量較差。一方面由于HIV亞型 gp41 基因間的差異，針對 gp41 蛋白的抗體具有型特異性，使用含單一亞型 gp41 表位的蛋白檢測HIV感染者血清會出現(xiàn)漏檢現(xiàn)象；另一方面，為了提升檢測試劑的免疫反應(yīng)性而增加蛋白的使用量或種類，結(jié)果導(dǎo)致檢測的特異性下降、假陽性率增高。

表1 重組蛋白包被活性檢測Table 1 ELISA detection of antigens coated by the recombinant protein

表2 國家藥品生物制品檢定所 HIV 參考血清檢測結(jié)果Table 2 ELISA detection of national drug testing of biological products inspection institute HIV panel

根據(jù)我們對HIV體外診斷使用原料的研究發(fā)現(xiàn)，選擇 gp41 表位的同時，需要對表達(dá)載體進行選擇，如利用不同表達(dá)載體表達(dá)的 gp41 融合蛋白在免疫反應(yīng)性和特異性上有一定的差異，因此提高原料的質(zhì)量不僅要選擇好 gp41 表位，還要選擇正確的融合基因。為了提升原料蛋白的質(zhì)量，我們采取的設(shè)計方案是首先將目前 HIV 主要流行亞型表位串聯(lián)在一起，其次找到一段保守基因與之融合。前期工作中，通過對目前我國 HIV 流行病學(xué)的研究，我們確認(rèn) BC 重組亞型和 AE 重組亞型為主要流行亞型，通過對兩種分離株 CRF-01、CRF-08基因的分析和比對，利用基因工程方法對其 gp41基因進行改造，選取保守性強的高表位區(qū)，對易引起非特異性的某些高表位區(qū)進行基因突變，最終優(yōu)化出一條含有多亞型表位的 gp41 基因片段。在融合基因的篩選實驗中，我們選擇了 dsbA、Trx、MBP、GST、cTnI 等五個蛋白的部分基因，分別與兩種亞型的 gp41 基因融合表達(dá)，通過活性檢測比較，cTnI 作為融合肽表達(dá)的融合蛋白表位暴露充分、特異性好。

為了獲得敏感性強、特異性高的 HIV 體外診斷用原料，本實驗在前期工作基礎(chǔ)上，獨創(chuàng)性地將部分 cTnI 基因與 HIV gp41 基因融合，融合基因成功克隆入大腸桿菌并在上清中得到了高效表達(dá)，通過金屬螯合親和層析純化，重組蛋白純度達(dá)到95％ 以上，達(dá)到體外診斷試劑對原料純度的要求。重組蛋白經(jīng)包被反應(yīng)板，間接 ELISA 檢測顯示對HIV-1 陽性血清具有較高的免疫反應(yīng)性，確證所表達(dá)重組蛋白的正確。我們將重組蛋白進行 HRP 標(biāo)記，與 HIV plate 反應(yīng)板配套進行了一系列實驗，結(jié)果顯示，檢測 1000 份 HIV 陰性血清標(biāo)本特異性達(dá) 99.9％，檢測國家藥品生物制品檢定所 HIV參考血清樣本顯示出較好的特異性和免疫反應(yīng)性，在臨床實驗中與國外同類試劑的比較也表現(xiàn)較優(yōu)。綜上，本次實驗達(dá)到預(yù)期的目標(biāo)，所獲得的重組蛋白可作為原料用于生產(chǎn) HIV 體外檢測試劑。

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Expression and purification of recombinant HIV-1 gp41 pr otein and determination of its immunoreactivity

LIANG Quan, LUO Chun-zhen, MAO Pei-ju, WANG Man

ObjectiveExpressions of HIV-1 gp41 antigen for in-vitro immunoassay.MethodsHIV-1 gp41 gene was amplified by PCR by using the plasmid X1 as a template, and then inserted into the plasmid E1 to construct recombinant plasmids E1-1. The expression of the recombinant plasmid in competent E.coli cell Bl21DE3 was induced with IPTG and analyzed with SDS-PAGE. After being purified by Ni-NTA affinity chromatography, the recombinant protein was further evaluated with ELISA for their functional characteristics.ResultsThe result from SDS-PAGE showed expression of E1-1 in the competent E.coli cell. The purity of the purified recombinantprotein was over 95％, and the protein has excellent immunoreactivity and specificity with ELISA.ConclusionsRecombinant protein E1-1 can be expressed with a high immunoactivity, which can be qualified for HIV ELISA production.

HIV-1; Recombinant proteins; Immunocompetence

WANG Man, Email: wangman@skhb.com

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2011.06.004

200233 上?？迫A生物工程股份有限公司

王縵，Email：wangman@skhb.com

2011-10-14

方法以含 HIV-1 gp41 基因的質(zhì)粒 X1 為模板，采用PCR 方法擴增出 gp41基因，克隆入 E1 載體構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒 E1-1，轉(zhuǎn)化 E.coli BL21DE3 感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)后，使用鎳螯合瓊脂糖親和層析柱（Ni-NTA Agaros）純化重組蛋白，通過 ELISA法檢測重組蛋白的免疫反應(yīng)性和特異性。

結(jié)果SDS-PAGE 鑒定結(jié)果表明，重組 E1-1 蛋白獲得了正確的表達(dá)；純化的重組 E1-1 蛋白純度 ＞ 95％；ELISA 檢測結(jié)果表明，重組 E1-1 蛋白具有較優(yōu)的免疫反應(yīng)性和特異性。結(jié)論 成功表達(dá)出具有較高免疫反應(yīng)性的重組 E1-1 蛋白，可應(yīng)用于 HIV 體外檢測試劑。

Author Affiliation:Shanghai Kehua Bio-engineering Co., Ltd (KHB), Shanghai 200233, China

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2011, 6(6):415-419