王卓，唐倩，呂茂民，馬玉媛，趙雄，章金剛

·生物診斷技術·

兩種ELISA試劑盒對我國單采血漿中水痘-帶狀皰疹病毒中和抗體滴度的測定和比較

王卓，唐倩，呂茂民，馬玉媛，趙雄，章金剛

目的采用兩種不同的檢測抗水痘-帶狀皰疹病毒（VZV）中和抗體間接ELISA 法試劑盒，對我國單采血漿中 VZV特異性免疫球蛋白（VZIG）的效價進行測定，比較兩種試劑盒測定結(jié)果的相關性和血漿篩查的適用性，并分析利用國內(nèi)單采血漿研發(fā)生產(chǎn) VZIG 的可行性。

皰疹病毒 3 型，人； 酶聯(lián)免疫吸附測定；免疫球蛋白

www.cmbp.net.cn 中國醫(yī)藥生物技術, 2011, 6(6):405-409

水痘-帶狀皰疹病毒（varicella-zoster virus，VZV）為雙鏈 DNA 病毒，屬于皰疹病毒科，α 病毒屬，人類是其唯一宿主，因此又稱人皰疹病毒3 型[1]。VZV 感染多發(fā)生于青少年時期，初次感染引發(fā)水痘，癥狀消失后病毒可潛伏在背根神經(jīng)節(jié)，再次激活而引發(fā)帶狀皰疹[2]。VZV 高危易感人群包括無水痘患病史或血清學檢測病毒中和抗體為陰性的免疫力缺陷患者、使用免疫抑制藥物的患者、新生兒以及孕產(chǎn)婦等，感染后可引起嚴重的并發(fā)癥[3-6]。此類易感患者如在暴露于 VZV 后 72 h 內(nèi)及時注射水痘特異性的免疫球蛋白（varicella-zoster immunoglobulin，VZIG）可有效地降低患病風險，減輕并發(fā)癥的嚴重程度[7-10]。

利用高通量、高特異性的篩查方法，獲得含有一定效價的 VZV 中和抗體的單采血漿是 VZIG的制備前提和關鍵。為了解我國單采血漿提供者VZV 中和抗體的水平，本研究采用病毒糖蛋白（glycoprotein，gp）包被的兩種商品抗VZV IgG 間接法 ELISA 試劑盒，對國內(nèi)單采血漿中VZV 中和抗體的效價進行測定，通過對兩種 ELISA 試劑盒檢測結(jié)果的比較和分析，探索利用中和抗體篩查技術研發(fā)制備 VZIG 的可行性，并為自行建立相關篩查技術提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1血漿樣品 血漿樣品來自國內(nèi)某血液制品廠漿站的單采血漿，符合《中國藥典》（2010 版，第三部）指定的血液制品人用原料血漿標準。隨機選取 182 份，其中男 109 份，女 73 份，平均年齡 41 歲，水痘患病史或水痘疫苗接種史不詳，置于 –80 ℃ 保存。

1.1.2gpELISA 試劑盒 抗VZV 中和抗體ELISA 檢測試劑盒分別為 Virion（ELISA Classic VZV IgG），購自德國 Serion 公司（批號 SKZ.CV）；VaccZyme（anti-VZV glycoprotein IgG），購自英國Binding Site 公司（批號為 298478）。

1.2 方法

1.2.1Virion 對血漿樣品 VZV 中和抗體的檢測 待測血漿樣品使用樣品稀釋液按照 1∶100 倍的比例進行稀釋，與質(zhì)控血漿、陰性血漿依次加入到微量滴定板中，每個樣品同時做 2 個復孔，37 ℃孵育 1 h 后依次加入酶標抗體、顯色液、終止液，于紫外光波 405 nm 處讀取吸光值。根據(jù)生產(chǎn)商提供的評估系統(tǒng)公式：濃度 = exp{6.427 － In[3.414/(樣本檢測平均值 × 1.06/質(zhì)控血漿平均值 － 0.003) － 1]/0.947}，計算各樣本中 VZIG 的效價。

1.2.2VaccZyme 對血漿樣品 VZV 中和抗體的檢測 單份血漿樣品使用生產(chǎn)商提供的樣品稀釋液，以 1∶100 倍的比例進行稀釋，與不同濃度（10.0、5.0、2.0、1.0 和 0.5 IU/ml）的 VZIG 標準品、高/低質(zhì)控血漿依次加入到微量滴定板中，每個樣品同時做 2 個復孔，室溫孵育 30 min 后依次加入抗人 IgG 抗體、酶標二抗以及顯色底物等，反應終止后在 450 nm 紫外光波處讀取各孔的吸光值。根據(jù)標準曲線方程計算各血漿樣品中 VZIG的濃度。

1.3 統(tǒng)計學處理

兩種 ELISA 試劑盒測定結(jié)果之間的相關程度采用直線相關與統(tǒng)計學方法進行分析，以Pearson乘積矩相關系數(shù)定量表述線性相關的程度，P＜ 0.05時為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 血漿樣品 VZV 中和抗體的效價測定結(jié)果

兩種 gpELISA 試劑盒測定的 182 份單人份血漿樣品中 VZV 中和抗體的效價見表 1。VZIG高于 10 IU/ml分別是 13 份（Virion）和 16 份（VaccZyme），占總樣本數(shù)的 7％ 和9％；效價小于 10 IU/ml 分別為 161 份（Virion）和 135 份（VaccZyme）；所測得的 VZIG平均效價為 2.5 IU/ml （Virion，174 份）和 1.8 IU/ml（VaccZyme，151 份）。其中，樣本稀釋后所測得的吸光值通過標準曲線方程計算無法得到有效值，即在試劑盒檢測限以外的樣本數(shù)分別是 8 份（Virion）和 31 份（VaccZyme），因此未納入結(jié)果分析。

表1 182 份原料血漿中 VZIG 效價的檢測結(jié)果Table 1 Titers of IgG to VZV in source plasma

2.2 Virion 和 VaccZyme 測定結(jié)果的相關性分析

分別以 Virion 和 VaccZyme 測定的同一樣本中 VZIG 效價對數(shù)值為橫、縱坐標上的取值，繪制散點圖，分析兩種試劑盒檢測結(jié)果是否存在有統(tǒng)計學意義的線性關系。由圖1可知，兩種 ELISA 檢測試劑盒的相關系數(shù) R2為 0.62，P＜ 0.0001，說明兩者檢測結(jié)果成良好的線性關系，即結(jié)果具有相關性。

2.3 Virion 和 VaccZyme 的結(jié)果差異性分析

繪制柱狀圖，對 Virion 和 VaccZyme 同時檢測的單份血漿樣品中 VZIG 的濃度進行比較，分析兩者的差異性。如圖2所示，同一份樣品 Virion高于 VaccZyme 為 90 份，Virion 低于 VaccZyme 為 61 份，兩者檢測結(jié)果的變異系數(shù)為 4％，說明在各自工作范圍內(nèi)，其對于同一份樣品的檢測結(jié)果具有很好的一致性。

2.4 Virion 和 VaccZyme 檢測靈敏性和適用性的分析

對在 Virion 檢測范圍內(nèi)且在 VaccZyme 檢測范圍之外的 22 份樣品計算濃度后可知，其 VZIG的效價均在 0.2 ～ 0.4 IU/ml之間，即該 22 份血漿樣本中的 VZIG 的效價低于 VaccZyme 的檢測下限，說明對于低效價的檢測，Virion 靈敏度要高于VaccZyme；而 VaccZyme 測定效價為 ＞ 150 IU/ml的樣本（n = 2），因高于 Virion 的檢測上限而無法計算，由此可知 VaccZyme 的工作上限較高，更適合高效價的樣本篩選。

圖2 Virion 和 VaccZyme 測定單采血漿 VZIG 效價的比較Figure 2 Comparison Virion and VaccZyme assays for detection the titer of VZV IgG in plasmapheresis donations

3 討論

水痘-帶狀皰疹病毒的基因組包括 71 個ORF，可編碼 33 種 VZV 特有蛋白和 13 種糖蛋白，其中已發(fā)現(xiàn)至少 gE（gp I）、gB（gp II）、gH （gp III）、gI（gp IV）、gC（gp V）和 gL（gp VI）等 6 種糖蛋白共同存在于病毒囊膜表面和感染細胞的膜表面[11]。體外研究證明，這 6 種糖蛋白均可誘導中和抗體的產(chǎn)生。中和抗體對于水痘感染、恢復期以及病毒激活引起的帶狀皰疹具有中和病毒、減輕癥狀、促進恢復的重要作用[12-13]。Mazur 等[14]研究結(jié)果表明，血清學檢測 VZV 抗體效價為陰性的人群對 VZV 的感染幾乎無任何抵抗力，而VZIG 的使用能夠有效地保護高危易感人群。

VZIG 是利用特定的血清學檢測方法將獲得的含有一定效價 VZV 中和抗體的單采血漿進行混合，并通過低溫乙醇分離方法和一系列的病毒滅活/去除工藝，制備的含有高效價VZV 中和抗體的特異性免疫球蛋白[15]。目前，可用于 VZIG 血清學檢測的方法主要有中和試驗、膜抗原熒光抗體試驗、補體結(jié)合試驗、放射免疫測定、ELISA 法等[16-17]。由于原料血漿篩查需要高通量、高特異性、易操作的方法，國際上市的 VZIG 產(chǎn)品多采用ELISA 法對單采血漿進行篩選。商品化的 VZV 抗體檢測試劑盒通常采用全病毒裂解液或純化的病毒膜表面糖蛋白進行包被，而病毒的中和抗原均為膜表面的糖蛋白，因此由 gpELISA 篩選獲得的原料血漿中 VZIG 的效價與金標準膜抗原熒光抗體試驗相比具有很好相關性，并且與單純皰疹病毒、CMV病毒等其他皰疹病毒的高免血漿無交叉反應[18-19]。

本研究使用 Virion 和 VaccZyme VZV IgG gpELISA 試劑盒對我國 182 份單采血漿中VZV中和抗體的效價進行測定，以判斷采用國內(nèi)原料血漿自行制備 VZIG 的可行性，并評估兩種試劑盒的相關性和適用范圍。已知歐盟 EMEA 批準 VZIG成品濃度為 100 IU/ml[20]，因此血漿篩查標準可初步定為 ＞ 10 IU/ml。通過檢測，符合此篩查標準的血漿在兩種試劑盒中的檢測結(jié)果分別是 13 份（7％，Virion）和 16 份（9％，VaccZyme），約占樣品總量的 7％，與國外篩選比例接近[21]。

通過對 Virion 和 VaccZyme 檢測結(jié)果的分析可知，其線性相關系數(shù) R2為 0.62（P ＜ 0.0001），檢測結(jié)果的變異系數(shù)為4％，說明兩者具有很好的相關性和一致性。但兩種試劑盒的工作范圍略有不同，其中 Virion 對于效價在 50 mIU/ml 以下的樣本具有很好的靈敏度，因此適用于流行病學監(jiān)測和疫苗接種評價等敏感性要求比較高的檢測；VaccZyme 對于效價在 150 IU/ml 以上的樣品具有較好靈敏度，更適用于高效價的原料血漿篩查。對于兩種 ELISA 試劑盒存在的差異，分析原因可能是生產(chǎn)商采用不同濃度的病毒糖蛋白抗原包被微量滴定板，或者是這兩種檢測體系分別采用了堿性磷酸酶和辣根過氧化物酶顯色系統(tǒng)，但是這種差異對于血漿篩查而言是可以接受的，提示了實驗室建立篩選方法時可根據(jù)需要選擇相應的反應系統(tǒng)。

結(jié)合國際篩選和制備 VZIG 的方法和標準[17-19]，本試驗的 ELISA 結(jié)果表明，使用國內(nèi)原料血漿制備水痘特異性免疫球蛋白具有可行性。在后續(xù)的研究中，相關的檢測結(jié)果需要經(jīng)典方法（中和試驗）和金標準（膜抗原免疫熒光法）進行驗證和復核；通過小量和中量制備的 VZIG 產(chǎn)品的終效價與原料血漿效價的比較，建立適用于生產(chǎn)的原料血漿最終篩查標準和方法。

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The detection and comparison of neutralizing antibodies response to Varicella-Zoster virus in domestic plasmapheresis donations using two commercial ELISA kits

WANG Zhuo, TANG Qian, LV Mao-min, MA Yu-yuan, ZHAO Xiong, ZHANG Jin-gang

ObjectiveTo use two different commercial enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kits in order to measure the titers of neutralization antibody to Varicella-zoster virus (VZV) in domestic plasmapheresis donations, and to compare the working range of the two kits for determination of which is more suitable for screening plasma or the preparation of varicella-zoster immuneglobulin (VZIG).MethodsVZV-specific envelope glycoproteins (gp) were used to coat the plate in two commercial ELISA kits (Virion/Serion andVaccZyme/Binding Site) and to determine the titers of neutralization antibody in 182 plasmapheresis donations. The plasma were diluted 100 folds and tested by the two kits at the same time. Then the titers were calculated by the system evaluated formula supplied by the manufacturer or standard curve obtained from the test, and the correlation between the two kits was examined by Pearson’s correlation coefficient test.Results① Results showed that there were 13 samples (7％, Virion) and 16 samples (9％, VaccZyme) with a titer of VZIG over 10 IU/ml respectively. ② Linear correlation between the two ELISA kits was 0.62 (P ＜ 0.0001), and the coefficient of variation was 4％. ③ The Virion kit had excellent sensitivity at a lower work range (0.2 ～ 0.4 IU/ml), whereas, the VaccZyme showed excellent and stable sensitivity in the titer values over 100 IU/ml.ConclusionsThere is a good concordance and correlation between Virion and VaccZyme. VaccZyme is more suitable for screening anti-VZV glycoprotein IgG because of its good stability in detecting the samples with highly titers. It is feasible to use domestic plasmapheresis donations for the preparation of VZIG.

Herpesvirus 3, human; Enzyme-linked immunosorbent assay; Immunoglobulins

ZHANG Jin-gang, Email: zhangjg@bmi.nic.ac.cn

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2011.06.002

100850 北京，軍事醫(yī)學科學院野戰(zhàn)輸血研究所血液制品與代用品實驗室

章金剛，Email：zhangjg@bmi.nic.ac.cn

2011-10-26

方法隨機選取 182 份單采血漿樣品，100 倍稀釋后，使用 Virion/Serion 和 VaccZyme/Binding Site 兩種商品試劑盒同時對樣品進行測定，根據(jù)評估系統(tǒng)公式或曲線方程計算每份樣品中 VZIG 的效價；采用Pearson 乘積矩相關性方法對兩種試劑盒的線性關系進行統(tǒng)計學分析。

結(jié)果①VZIG 高于 10 IU/ml 的血漿樣品數(shù)量為 13 份（7％，Virion）和 16 份（9％，VaccZyme）；②兩種試劑盒檢測結(jié)果之間的直線線性關系數(shù) R2為 0.62（P ＜ 0.0001），變異系數(shù)為 4％；③Virion 與VaccZyme 的工作范圍有不同，前者對于低效價（0.2 ～ 0.4 IU/ml）樣本的測定具有很好的靈敏度，而 VaccZyme 適用于高效價血漿樣本（＞150 IU/ml）的檢測。

結(jié)論Virion 與 VaccZyme 結(jié)果具有一致性和相關性；兩種試劑盒的工作范圍略有差異，VaccZyme 較Virion 更適用于高效價 VZIG 原料血漿的檢測，可用于普通獻漿員單采血漿中 VZV 中和抗體的篩查。

Author Affiliation:Key Laboratory for Blood Products and Blood Substitutes, Institute of Transfusion Medicine, the Academy of Military Medicine Science (AMMS), Beijing 100850, China

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2011, 6(6):405-409