陳 亮 黃 亮 李靜琴

不同芽孢桿菌對(duì)雛雞細(xì)菌性腹瀉病原菌的體外抑菌試驗(yàn)

陳 亮 黃 亮 李靜琴

研究不同芽孢桿菌對(duì)雛雞細(xì)菌性腹瀉病原菌的體外抑菌作用。采用稀釋分離法從不同來源的樣品中分離得到芽孢桿菌菌株41株；以3種雛雞細(xì)菌性腹瀉病原菌為指示菌，采用牛津杯法進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)6株菌株對(duì)病原菌均具有明顯的體外抑菌作用，抑菌效果最好的為菌株B332，其次為菌株D4；經(jīng)形態(tài)特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析，菌株D4和B332應(yīng)分別歸屬于巨大芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌。

芽孢桿菌；雛雞；細(xì)菌性腹瀉；抑菌作用

雞腹瀉是一類可引起雞拉稀、下痢疾病的總稱，可導(dǎo)致雞食欲減退、生長(zhǎng)受阻或停滯、產(chǎn)蛋量明顯下降甚至死亡等。該病發(fā)生率高，一般在10%～30%，且死亡率高，長(zhǎng)期以來一直困擾著養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失?，F(xiàn)有研究表明，細(xì)菌性因素是引起雛雞腹瀉的主要原因，病原菌以雞致病性大腸桿菌(Escherichia coli)、雞白痢沙門氏菌(Salmonellosis avium)和雞志賀氏菌(Shigella spp.)等最為常見(甘孟侯,1999;張丁華等,2010)。目前，治療雞細(xì)菌性腹瀉主要依賴于抗生素的使用，但由于長(zhǎng)期不合理使用抗生素，已經(jīng)導(dǎo)致出現(xiàn)強(qiáng)耐藥病原菌和抗生素殘留超標(biāo)等嚴(yán)重問題。隨著人民對(duì)食品安全的日益關(guān)注，探索新的防治方法勢(shì)在必行。本試驗(yàn)從微生態(tài)理論角度出發(fā)，從不同來源的樣品中分離芽孢桿菌，并具體研究其對(duì)雛雞細(xì)菌性腹瀉病原菌的體外抑菌作用，以期為芽孢桿菌用于預(yù)防治療雛雞細(xì)菌性腹瀉病原菌和禽用微生態(tài)制劑的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 樣品

青海野生高原牦牛牛糞、陜西省蘋果園根際土壤、鄭州本地養(yǎng)雞場(chǎng)健康雞腸道內(nèi)容物。

1.2 菌株和培養(yǎng)基

芽孢桿菌菌株分離自上述3種樣品；雞致病性大腸桿菌(Escherichia coli,E)、雞白痢沙門氏菌(Salmonellosis avium,SA)和雞志賀氏菌(Shigella spp.,SS)，購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所。營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(NA)用于菌株的分離、培養(yǎng)、保存，營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(NB)用于菌株的液體培養(yǎng)。

1.3 器材

生化培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床、高速冷凍離心機(jī)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、顯微鏡、牛津杯等。

2 方法

2.1 芽孢桿菌的分離

將各樣品80℃水浴熱處理10min后，采用稀釋涂布法進(jìn)行芽孢桿菌菌株的分離。挑取性狀差異明顯的菌落，劃線純化、編號(hào)、保存、備用。

2.2 芽孢桿菌培養(yǎng)濃縮液制備

將各芽孢桿菌活化后，接入NB培養(yǎng)液，30℃、150 r/min下培養(yǎng)24 h后，將培養(yǎng)液按5%(v/v)的接種量接入裝有150ml NB培養(yǎng)液的500ml的三角瓶，繼續(xù)培養(yǎng)36 h得菌株培養(yǎng)液。4℃、12000 r/min下離心20 min取上清液，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀40℃下進(jìn)行10倍濃縮，得濃縮液。

2.3 病原菌菌懸液制備

將各病原菌活化后，接入NB培養(yǎng)液，37℃、150 r/min下?lián)u床培養(yǎng)24 h得培養(yǎng)液，經(jīng)無菌生理鹽水稀釋制得106cfu/ml的菌懸液。

2.4 抑菌試驗(yàn)

分別以3種病原菌為指示菌，采用牛津杯法(劉冬梅等，2006)進(jìn)行芽孢桿菌對(duì)雛雞細(xì)菌性腹瀉病原菌的體外抑菌試驗(yàn)。取100μl病原菌菌懸液均勻涂布于NA培養(yǎng)基平板，無菌放置3只牛津杯于培養(yǎng)皿，吸取200μl芽孢桿菌培養(yǎng)濃縮液加入牛津杯中，將培養(yǎng)皿置于4℃冰箱擴(kuò)散24 h，取出后37℃下恒溫培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌圈直徑。每處理重復(fù)3次。

2.5 菌株鑒定

參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》(東秀珠等，2001)進(jìn)行菌株的形態(tài)特征和生理生化特征鑒定，參照潘康成等(2010)的方法進(jìn)行菌株的16S rDNA測(cè)序鑒定。

3 結(jié)果與分析

3.1 芽孢桿菌分離結(jié)果(見表1)

表1 芽孢桿菌菌株分離結(jié)果

如表1所示，從不同來源的3份樣品中共分離得到芽孢桿菌菌株41株，分別編號(hào)、保存，進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)。

3.2 抑菌試驗(yàn)結(jié)果(見表2)

表2 芽孢桿菌培養(yǎng)濃縮液對(duì)雛雞細(xì)菌性腹瀉病原菌的抑菌作用

以3種病原菌為指示菌，采用牛津杯法進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)。結(jié)果顯示，41株芽孢桿菌菌株中有6株對(duì)雛雞細(xì)菌性腹瀉病原菌均具有明顯的體外抑菌作用，如表2所示。菌株D4和B332抑菌作用最佳，對(duì)其進(jìn)行菌株鑒定。

3.3 菌株鑒定結(jié)果

3.3.1 菌株形態(tài)特征和生理生化特征

菌株D4細(xì)胞短桿狀，G+，芽孢中生、卵圓形，在NA培養(yǎng)基平板上菌落圓形、白色、邊緣裂葉狀，表面起皺、不透明；菌株B332細(xì)胞短桿狀，G+，芽孢中生、卵圓形，在NA培養(yǎng)基平板上菌落圓形、白色微黃，表面凸起粗糙、不透明。菌株D4和B332的生理生化特征與枯草芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)株保持一致，過氧化氫酶、硝酸鹽還原、淀粉水解、酪素水解、檸檬酸鹽利用、V.P試驗(yàn)均為陽性，厭氧生長(zhǎng)、吲哚實(shí)驗(yàn)、H2S產(chǎn)生均為陰性，可在含10%NaCl和pH值5.7的NA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。

3.3.2 16S rDNA序列分析

利用NCBI的Blast程序進(jìn)行菌株16S rDNA序列同源性分析，發(fā)現(xiàn)菌株D4的16S rDNA序列(FJ755786)與 Bacillus megaterium 108 (AB334764)、Bacillus megaterium An11-2(AB244448)的16S rDNA序列同源性達(dá)到100%，菌株B332的16S rDNA序列(HM136793) 與 Bacillus subtilis EA6-2 (JF496430)和BacillussubtilisWA3-4(JF496477)的序列同源性達(dá)到100%。

3.3.3 小結(jié)

綜合菌株形態(tài)特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析，菌株D4和B332應(yīng)分別歸屬于巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。

4 討論

芽孢桿菌是一類在自然界中廣泛存在、好氧或兼性好氧、可形成芽孢的G+細(xì)菌，是國(guó)際公認(rèn)的可在飼料中直接使用的微生物菌種。本試驗(yàn)以3種雛雞細(xì)菌性腹瀉病原菌為指示菌，采用牛津杯法進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)巨大芽孢桿菌D4和枯草芽孢桿菌B332對(duì)病原菌均具有明顯的體外抑菌作用。

隨著畜牧業(yè)的迅速發(fā)展和人民對(duì)食品安全的日益關(guān)注，微生態(tài)制劑以其綠色無污染、無殘留等特點(diǎn)備受國(guó)內(nèi)外廣大研究者的青睞，其中在歐美和日本等國(guó)家以枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等為主的禽用微生態(tài)制劑已經(jīng)廣泛應(yīng)用。而國(guó)內(nèi)的研究相對(duì)落后，源于對(duì)動(dòng)物本身腸道的益生微生物菌株的研究較少。巨大芽孢桿菌D4分離自海拔3000m以上高寒、無污染草原上生長(zhǎng)的野牦牛牛糞，牛糞干物質(zhì)主要是被瘤胃降解后的食料殘余，混雜有大量的瘤胃共生微生物。由于野牦牛的生存環(huán)境幾乎未受人類生產(chǎn)活動(dòng)的影響，其瘤胃共生微生物的種群結(jié)構(gòu)和物種組成可以認(rèn)為完全是自然選擇的結(jié)果(陳亮,2009)，為益生微生物菌株的篩選提供了新的來源?？莶菅挎邨U菌B332分離自健康雞的腸道內(nèi)容物，根據(jù)宿主微生態(tài)特異性理論，本源腸道微生物將更易于在其腸道中定植和發(fā)揮作用，因此，由雞腸道內(nèi)正常菌群的分離得到對(duì)雛雞細(xì)菌性腹瀉病原菌具有明顯的抑菌作用的芽孢桿菌為防治雛雞細(xì)菌性腹瀉病奠定了基礎(chǔ)。作為微生態(tài)制劑的潛在生產(chǎn)菌株，菌株D4和B332的抑菌機(jī)理、產(chǎn)酶能力及其復(fù)合使用將有待于進(jìn)一步研究。

若干篇，刊略，需者可函索）

（編輯：劉 占，laram ie_liu@yahoo.com）

S831.7

A

1001-991X（2011）18-0056-02

陳亮，河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，博士，450001，河南鄭州市高新區(qū)蓮花街。

黃亮、李靜琴，單位及通訊地址同第一作者。

2011-07-04

河南省重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目[112102110018]；河南工業(yè)大學(xué)引進(jìn)人才專項(xiàng)基金資助項(xiàng)目[2009BS052]；河南工業(yè)大學(xué)科研基金招標(biāo)項(xiàng)目[10XZP004]