姚曉紅 吳逸飛 王新 孫宏 錢(qián)彬 張博 湯江武

我國(guó)是菜籽粕產(chǎn)量居世界第一的國(guó)家，每年產(chǎn)量可達(dá)近千萬(wàn)噸。菜籽粕營(yíng)養(yǎng)豐富，粗蛋白含量達(dá)35%～45%，同時(shí)含有較豐富的Ca、Mg、P、Se及多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其中Se含量在植物性蛋白中含量最高[1]。菜籽蛋白幾乎不存在限制性氨基酸，且其氨基酸組成接近聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（FAO）和世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦值，是優(yōu)良的天然植物蛋白資源[2]。但由于菜籽粕中含有硫代葡萄糖苷（硫苷）、植酸等抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)[3]，降低了蛋白質(zhì)（氨基酸）的消化利用率，極大地限制了其在畜禽日糧中的應(yīng)用。

國(guó)內(nèi)外學(xué)者曾采用微生物發(fā)酵法對(duì)菜籽粕進(jìn)行脫毒，取得了顯著效果；同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)，菜籽蛋白經(jīng)微生物降解后可得到低分子量的菜籽肽。菜籽肽具有低抗原性、酸溶性、低黏度等特點(diǎn)，且在體內(nèi)消化吸收快，能有效提高菜籽蛋白利用率[4]。目前，單一依靠微生物發(fā)酵所得菜籽肽含量較少。因此，本研究在前期獲得優(yōu)良脫毒菌株及最佳脫毒工藝的基礎(chǔ)上，以菜籽蛋白降解為目標(biāo)，嘗試在微生物發(fā)酵脫毒的基礎(chǔ)上添加中性蛋白酶，進(jìn)行菌酶協(xié)同酵解工藝研究，以期擴(kuò)大菜籽肽得率，為進(jìn)一步提高菜籽粕的利用率提供支持。

1.材料與方法

1.1 原料及菌種

菜籽粕購(gòu)自紹興中大飼料有限公司，粗蛋白含量≥32%，硫苷含量≥35 μmol/g；中性蛋白酶購(gòu)自Sigma 公司，酶活 500 U/mg；枯草芽孢桿菌 B1（Bacillus subtilis－B1）為本實(shí)驗(yàn)室篩選獲得的高效硫苷降解菌，于－4℃保藏于斜面培養(yǎng)基。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：牛肉膏 5 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、瓊脂 2%，pH 值 7.0～7.2，H2O 1000 ml。

液體培養(yǎng)基：不加瓊脂，其余成分與斜面培養(yǎng)基相同。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：菜籽粕100%、料水比1：1，pH值自然。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

無(wú)菌條件下接一環(huán)斜面菌種B1于液體培養(yǎng)基中，于37℃、200 r/min培養(yǎng)20 h，菌體濃度達(dá)108CFU/ml。

1.3.2 菜籽粕菌酶酵解的方法

稱(chēng)取100 g新鮮菜粕，加入100 ml H2O，按2%（菜籽粕干料重）的接種量、100 U/g(菜籽粕干料重)的加酶量加入活化液體菌液、中性蛋白酶（具體接種和加酶的方式見(jiàn)表1)，混合均勻，裝入500 ml罐頭瓶中，用無(wú)菌報(bào)紙封口，置于30℃培養(yǎng)48 h，分別在試驗(yàn)設(shè)定時(shí)間取出，50℃烘干至恒重，粉碎過(guò)80目篩待測(cè)。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

設(shè)計(jì)4種不同的菌酶發(fā)酵菜粕方式（見(jiàn)表1）。以硫苷降解和肽含量為指標(biāo)，在獲得的最佳發(fā)酵方式下，以肽含量為指標(biāo)，分別進(jìn)行不同B1接種量(1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%)、不同酶添加量(50、100、150、200、250 U/g) 和不同料水比（1：0.8、1： 0.9、1： 1.0、1： 1.1、1：1.2）的單因素試驗(yàn)。

表1 菌酶發(fā)酵菜粕方式

1.3.4 正交試驗(yàn)

發(fā)酵工藝優(yōu)化采用3因素3水平L9（33）正交試驗(yàn)，共設(shè)9個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，各參數(shù)水平根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇接種量、酶添加量、料水比3個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，隨后篩選出優(yōu)化組合。

1.3.5 檢測(cè)方法

硫苷含量檢測(cè)采用氯化鈀分光光度法[5]；硫苷分解產(chǎn)物異硫氰酸酯(ITC)和噁唑烷硫酮(OZT)含量檢測(cè)參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) GB 13087—91 GB 13089—91[6－7]；單寧含量檢測(cè)參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 15686—2008[8]；植酸含量檢測(cè)采用分光光度法[9]；粗蛋白含量檢測(cè)采用凱氏定氮法[10]；菜籽肽含量檢測(cè)：稱(chēng)取過(guò)80目篩的待測(cè)樣品，加入等體積10%三氯乙酸(TCA)，在160 r/min下振蕩30 min，而后4000 r/min離心15 min，取上清液采用Folin－酚法[11]測(cè)定蛋白質(zhì)總量；菜粕蛋白分布采用SDS－PAGE凝膠電泳[12]；還原糖含量檢測(cè)采用DNS分光光度法[11]；鈣含量檢測(cè)參照[13]GB/T 13885—2003，磷含量檢測(cè)參照[14]GB/T 6437—2002。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和方差分析,多重比較采用LSD法，顯著水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌酶協(xié)同酵解菜粕方式的確定(見(jiàn)表2)

表2 發(fā)酵方式對(duì)菜籽肽和硫苷含量的影響

由表2可知，處理方式3，即菌酶同步發(fā)酵，在菜籽肽含量提高和硫苷降解方面，同時(shí)取得較好的效果，硫苷降解率達(dá)到68.10%，菜籽肽含量為140.78 mg/g，比發(fā)酵前提高了3.21倍。而處理4，即菌酶分步發(fā)酵方式，雖然菜籽肽含量的提高效果明顯，但硫苷降解效果較差。因此，選擇菌酶同步添加的方式進(jìn)行協(xié)同酵解后續(xù)的單因素試驗(yàn)。

2.2 菌酶協(xié)同酵解條件研究

2.2.1 接種量對(duì)菜籽肽含量的影響(見(jiàn)圖1)

圖1 接種量對(duì)菜籽肽含量的影響

隨著接種量的增加，菜籽肽含量呈現(xiàn)先增加、后下降的變化過(guò)程。當(dāng)接種量為1.5%時(shí)，菜籽肽含量達(dá)156.4 mg/g，接種量為2%時(shí)，菜籽肽含量達(dá)164.3 mg/g，增加幅度不大，因此本試驗(yàn)選擇適宜接種量為1.5%。

2.2.2 酶添加量對(duì)菜籽肽含量的影響(見(jiàn)圖2)

圖2表明，當(dāng)中性蛋白酶添加量為100 U/g時(shí)，菜籽肽含量達(dá)到161.2 mg/g；當(dāng)酶添加量為250 U/g時(shí)，菜籽肽含量最高，達(dá)166.4 mg/g，與添加100 U/g相比，增加幅度不大，考慮到加酶成本，本試驗(yàn)確定酶的適宜添加量為100 U/g。

圖2 酶添加量對(duì)菜籽肽含量的影響

2.2.3 料水比對(duì)菜籽肽含量的影響(見(jiàn)圖3)

圖3 料水比對(duì)菜籽肽含量的影響

結(jié)果表明，隨著發(fā)酵體系中水分含量的增加，菜籽肽含量呈逐漸增加的趨勢(shì)，但考慮到含水率增加時(shí)，會(huì)顯著影響到硫苷的脫毒效果，而料水比在1：1、1：1.1和1：1.2時(shí)，對(duì)菜籽肽含量的影響不大，因此確定最適料水比為1：1。

2.2.4 菌酶協(xié)同酵解條件的正交試驗(yàn)

以菜籽肽含量為指標(biāo)，選取接種量、酶添加量和料水比進(jìn)行3因素3水平正交試驗(yàn)試驗(yàn)，因素水平編碼表和設(shè)計(jì)實(shí)施方案見(jiàn)表3。試驗(yàn)結(jié)果及方差分析見(jiàn)表4和表5。

表3 正交試驗(yàn)因素水平

正交試驗(yàn)的結(jié)果顯示，接種量、酶添加量和料水比3個(gè)因素中，酶添加量和接種量是影響小肽含量的顯著因素。3個(gè)因素對(duì)小肽含量的影響，依次為酶添加量>接種量>料水比。根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果確定的最佳發(fā)酵條件為：接種量為1.0%，酶添加量為150 U/g，料水比為1：1.0。

表4 菌酶協(xié)同酵解正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表5 菌酶協(xié)同酵解正交試驗(yàn)的方差分析

2.3 菌酶協(xié)同酵解菜粕營(yíng)養(yǎng)成分分析

根據(jù)正交試驗(yàn)得到的最佳條件，進(jìn)行菌酶協(xié)同酵解菜籽粕，并對(duì)處理前后的菜籽粕進(jìn)行了營(yíng)養(yǎng)成分分析和蛋白凝膠電泳，結(jié)果見(jiàn)表6和圖4。

表6 菜粕發(fā)酵后抗?fàn)I養(yǎng)因子含量和營(yíng)養(yǎng)成分分析

表6結(jié)果表明，經(jīng)菌酶協(xié)同酵解后，菜粕中硫苷的含量為9.71 μmol/g，降解率達(dá)74.23%，其分解產(chǎn)物異硫氰酸酯（ITC）和噁唑烷硫酮（OZT）的含量分別比發(fā)酵前降低了79.07%和55.56%；發(fā)酵后菜粕中單寧和植酸含量分別降低了31.17%和16.39%；發(fā)酵后菜粕樣品中粗蛋白含量達(dá)41.30%，比發(fā)酵前提高1.92%，菜籽肽含量達(dá)170.12 mg/g，比發(fā)酵前提高了3.7倍，還原糖含量達(dá)14.68%，比發(fā)酵前提高了57.68%，發(fā)酵后鈣、磷含量分別達(dá)1.04%和1.35%，分別比發(fā)酵前提高了26.83%和11.57%。

圖4 發(fā)酵菜粕樣品的SDS-PAGE電泳圖

SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示（見(jiàn)圖4），與原菜粕相比較，菌酶協(xié)同酵解工藝處理后，菜籽蛋白的大分子量亞基均有不同程度降解，且高于25 kD的高分子肽鏈降解比較完全，另外，14.4 kD以下的蛋白條帶已不存在，說(shuō)明這些蛋白也被降解為分子量更小的蛋白了。

3 討論

菜籽粕中存在較多的抗?fàn)I養(yǎng)因子，其中硫苷是最主要的抗?fàn)I養(yǎng)因子，其含量較高。物理法和化學(xué)法脫毒存在耗能高、蛋白損失大、成本昂貴[15-17]等缺陷限制了其使用，微生物發(fā)酵法脫毒因其在很多方面能克服物理和化學(xué)法的缺點(diǎn)而受到普遍的重視和應(yīng)用。本試驗(yàn)中，采用微生物發(fā)酵協(xié)同酶解處理后，菜籽粕中硫苷的降解率達(dá)74.23%，與黃茜等[18]利用篩選獲得的枯草芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌和釀酒酵母進(jìn)行菜粕發(fā)酵，得到硫苷的降解率達(dá)到89.06%的結(jié)果一致。同時(shí)，試驗(yàn)還表明，通過(guò)發(fā)酵可提高菜籽粕中的粗蛋白含量。劉軍等[19]從土壤中分離出若干霉菌、酵母菌和細(xì)菌，對(duì)其中3支菌株混合發(fā)酵，結(jié)果菜粕的粗蛋白含量提高了23%；國(guó)外Adarsh Palvig[20]利用少孢根霉發(fā)酵菜籽餅粕也發(fā)現(xiàn)蛋白含量得到增加。試驗(yàn)證實(shí)了微生物發(fā)酵是改良菜籽粕的有效手段。

目前，對(duì)植物源蛋白及活性肽的研究日益成為食品、醫(yī)藥及飼料等領(lǐng)域的熱點(diǎn)。本試驗(yàn)中小肽含量比發(fā)酵前提高了3.7倍，菜籽粕中還原糖、Ca、P含量分別比發(fā)酵前提高了57.68%、26.83%和11.57%。同時(shí)SDS-PAGE蛋白凝膠電泳結(jié)果也表明，菜粕經(jīng)菌酶協(xié)同酵解后，蛋白組分中高于25 kD的大分子蛋白得到了較充分的降解。據(jù)報(bào)道，用蛋白酶酶解制備菜籽肽，可得到分子量較小的小肽，且蛋白水解度較高[21-22]。但作為飼料添加劑生產(chǎn)成本太高，同時(shí)酶解法對(duì)植物源蛋白中抗?fàn)I養(yǎng)因子的去除效果并不理想。采用菌酶協(xié)同酵解法制備菜籽肽，枯草芽孢桿菌能分解其中的抗?fàn)I養(yǎng)因子作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供自身的生長(zhǎng)，從而達(dá)到脫毒的效果，同時(shí)外源蛋白酶與微生物發(fā)酵產(chǎn)生的酶，將大分子量的蛋白降解為小分子量的蛋白肽，可有效提高菜粕的品質(zhì)及蛋白利用率，為菜籽粕的深入開(kāi)發(fā)提供新的途徑。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)對(duì)菌酶協(xié)同酵解生產(chǎn)高品質(zhì)菜粕的發(fā)酵工藝進(jìn)行了研究，通過(guò)單因素及正交試驗(yàn)，確定了采用枯草芽孢桿菌與中性蛋白酶同步發(fā)酵的方式，當(dāng)接種量為1.0%，酶添加量為150 U/g，料水比為1：1.0，發(fā)酵溫度為35℃，發(fā)酵時(shí)間為48 h時(shí)，菜籽粕中硫代葡萄糖苷（硫苷）的降解率達(dá)74.23%，其分解產(chǎn)物異硫氰酸酯（ITC）和噁唑烷硫酮（OZT）的含量分別比發(fā)酵前降低了79.07%和55.56%；發(fā)酵后菜粕中單寧和植酸含量分別降低了31.17%和16.39%；發(fā)酵后菜籽粕中粗蛋白含量達(dá)41.30%，比發(fā)酵前提高1.92%，菜籽肽含量達(dá)170.12 mg/g，比發(fā)酵前提高了3.7倍，還原糖含量比發(fā)酵前提高了57.68%，鈣、磷含量分別比發(fā)酵前提高了26.83%和11.57%。同時(shí)，SDS-PAGE電泳結(jié)果表明，菌酶協(xié)同酵解工藝處理后，菜籽蛋白中大分子量亞基均得到較好的降解效果。

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