曹會彥 劉智明 乜國雁 章曉東 王國錄 韓永剛 易文發(fā) 于 湧 朱明挺 李子剛

(青海省人民醫(yī)院泌尿外科，青海 西寧 810007)

最近20年，隨著對膀胱癌遺傳學改變的深入研究，研究者發(fā)現(xiàn)膀胱癌的發(fā)生與3、7、17號染色體非整倍體改變及9號染色體 p16 位點缺失密切相關(guān)〔1，2〕。熒光原位雜交(FⅠSH)通過采用熒光標記的核酸探針可以檢測染色體的變異。2007年衛(wèi)生部醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展研究中心組織全國47家三級醫(yī)院多中心、大規(guī)模探索中國人群在部分腫瘤的遺傳學異常特點(其中包括膀胱癌)，研究FⅠSH檢測在中國的可行性及科學性。我院作為青海省唯一參加單位，通過本課題探討了FⅠSH技術(shù)在我省的應(yīng)用前景，以期提高青海省尿路移行上皮癌的早期診斷率。我們于2007年10月至2009年4月應(yīng)用FⅠSH檢測20例正常人及91例疑似尿路移行上皮腫瘤患者的尿脫落細胞3、7、17號染色體及9p16區(qū)帶的畸變情況，初步探討FⅠSH在中國人群中診斷膀胱癌的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 20例無肉眼血尿及其他泌尿系統(tǒng)疾病的正常對照組，年齡50～81歲，平均64.5歲。91例疑似尿路移行上皮腫瘤的肉眼血尿患者組，其中男性66例，年齡47～83歲，平均62.4歲，女性25例，年齡52～79歲，平均64.6歲。所有入選病例均簽署知情同意書。

1.2 尿液留取及檢測 每例患者均連續(xù)3 d留取晨尿200 ml，1 h內(nèi)送檢，一部分經(jīng)離心后制備脫落細胞玻片，由指定的病理科醫(yī)師進行細胞形態(tài)學檢查，另一部分等待進行FⅠSH檢測。健康人留取晨尿200 ml直接進行FⅠSH檢測。

1.3 FⅠSH檢測方法 本課題應(yīng)用金菩嘉醫(yī)療科技有限公司提供的DNA FⅠSH探針。所用的FⅠSH探針包括GLP P16/GLP P17探針和CSP3/CSP7探針，熒光顯微鏡下均可見紅色與綠色兩種信號。GLP P16/GLP P17探針常見異常類型為P16缺失;17號染色體非整倍性，正常細胞應(yīng)為2紅/2綠，異常信號包括:1紅/2綠、0紅/2綠、2紅/3綠、1紅/3綠。CSP3/CSP7探針常見異常為3號及7號染色體非整倍性，正常細胞應(yīng)為2紅/2綠，異常信號包括:3紅/2綠、2紅/3綠、3紅/3綠。

1.3.1 探針混合物準備及變性 室溫下將7μl雜交緩沖液、1μl去離子水、2μl探針加入到微量離心管中，離心1～3 s。將裝有10μl以上探針混合物的試管置于(73±1)℃水浴箱變性5 min之后，將該試管置于45℃ ～50℃水浴箱中，雜交前取出。探針準備好之后，玻片應(yīng)置于45℃ ～50℃烤片機上預熱。

1.3.2 探針與樣本雜交 將10μl變性后的探針混合物滴于玻片雜交區(qū)域，立即加蓋蓋玻片，用橡皮膠封邊。將玻片置于預熱的濕盒中，42℃保溫箱中過夜雜交。

1.3.3 玻片洗滌

1.3.3.1 洗滌液準備 室溫下將50%甲酰胺/2×SSC溶液(A液)倒入三個分別標記“1”、“2”、“3”的考普林瓶中。使用前將盛有溶液的考普林瓶置于(46±1)℃水浴箱中至少30 min，使溶液達到所需溫度。分別將50 ml 2×SSC溶液(B液)和2×SSC/0.1%NP洗液(C液)倒入考普林瓶中，使用前將盛有溶液的考普林瓶置于(46±1)℃水浴箱中至少30 min，使溶液達到所需溫度。

1.3.3.2 洗滌程序 ①移去蓋玻片，立即將玻片注意置于盛有50%甲酰胺/2×SSC溶液(A液)的瓶“1”中，晃動玻片1～3 s。按此重復另外幾張玻片。②5～10 min后取出玻片。③將玻片置于盛有A液的瓶“2”中，晃動玻片1～3 s，5～10 min后取出玻片。④將玻片置于盛有A液的瓶“3”中，晃動玻片1～3 s，5～10 min后取出玻片。⑤將玻片置于盛有2×SSC溶液(B液)的瓶中，晃動玻片1～3 s，10 min后取出玻片。⑥將玻片置于盛有2×SSC/0.1%NP洗液(C液)的瓶中，晃動玻片1～3 s，5 min后取出玻片。⑦將玻片室溫浸泡在70%乙醇中，3 min后取出玻片。

1.3.4 觀察 ①暗處自然干燥玻片。②將5μl DAPⅠ復染劑滴加于雜交區(qū)域位置，立即蓋上蓋玻片。暗處放置10～20 min后，熒光顯微鏡下選用合適的濾波片組觀察玻片。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 診斷閾值的建立 20例正常人尿液，采用以上方法步驟制備玻片及進行FⅠSH實驗，進行閾值測定。見表1。

表1 20例正常人尿液閾值

2.2 FⅠSH檢測的結(jié)果 以膀胱鏡和術(shù)后病理檢查為診斷依據(jù)，91例行FⅠSH檢測的患者，通過膀胱鏡活檢或手術(shù)后病理檢查明確診斷為膀胱癌患者83例，泌尿系良性病變?yōu)?例。根據(jù)WHO分級法，其中16例為G1，48例為G2，19例為G3，根據(jù)TNM 分期系統(tǒng)，4例為 Ta，12例為 T1，34例為 T2，23例為 T3-4。

對91例行FⅠSH檢測的患者對于腫瘤的敏感性和特異性進行分析，其敏感性為97.6%，特異性為92.9%。尿脫落細胞學的敏感性為43.4%，特異性為92.9%。FⅠSH與尿脫落細胞學在診斷膀胱癌中敏感性有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，特異性相近，無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。FⅠSH檢測 G1、G2、G3級敏感性分別為 93.8%、97.9%、100%，Ta、T1、T2、T3-4各期的敏感度分別為75%、91.7%、100%、100%。尿脫落細胞學 G1、G2、G3級敏感性分別為 31.2%、37.5%、68.4%，Ta、T1、T2、T3-4各期的敏感度分別為0%、41.7%、55.9%、52.2%。

3 討論

膀胱癌患者的診斷主要依靠膀胱鏡及尿脫落細胞學檢查，但膀胱鏡檢查為有創(chuàng)性，患者痛苦，難以接受，且對于肉眼見不到的腫瘤的診斷也存在困難;尿脫落細胞雖說特異性較高，但對低分級腫瘤的敏感性則較低，用于診斷膀胱癌及監(jiān)測復發(fā)亦不理想，有報道尿脫落細胞學檢測膀胱癌的敏感度為13%～75%，特異度為85% ～100%〔3〕。除尿脫落細胞學檢查外，通過尿液的檢查還有尿核基質(zhì)蛋白22、膀胱腫瘤抗原、免疫-細胞檢查法等方法，但這些檢測方法敏感性和特異性均不十分理想。而檢測尿液的端粒酶、透明質(zhì)酸和透明質(zhì)酸酶的方法其敏感性和特異性較好，但尚未經(jīng)多中心的研究證實。

FⅠSH是一門新興的分子細胞遺傳學技術(shù)，目前這項技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用與動植物基因結(jié)構(gòu)以及染色體精細結(jié)構(gòu)變異分析、病毒感染分析、人類產(chǎn)前診斷、腫瘤遺傳學和基因進化研究等領(lǐng)域。FⅠSH采用熒光標記的DNA探針，根據(jù)探針與被檢測樣本中DNA序列的互補性，探針與DNA雜交后，在熒光顯微鏡下檢測DNA序列在染色體或DNA纖維切片上的定性、定位、相對定量分析。技術(shù)本身相對簡單，重復性好、穩(wěn)定，并具有極有效的靈敏性和特異性。因此，F(xiàn)ⅠSH很適應(yīng)于臨床醫(yī)學檢測。

本研究中我們使用了能標記3、7、17和9p16染色體的探針，應(yīng)用FⅠSH技術(shù)，該方法靈敏度較為理想，特異度有待改進，考慮這與樣本量較小有關(guān)，同時也與檢測人員的鏡下判斷有關(guān)。應(yīng)用FⅠSH技術(shù)進行遺傳學改變的檢測對膀胱癌(包括尿路上皮癌)的早期診斷及預后評估具有很大意義，其靈敏度高于細胞形態(tài)學檢測，特異性則與細胞形態(tài)學相當(尿脫落細胞學檢查對膀胱癌診斷的敏感性為43.4%，特異性為92.9%)，本研究中，F(xiàn)ⅠSH出現(xiàn)2例假陰性，可能與腫瘤小、級別低、僅限于黏膜層致尿脫落細胞少或細胞尚未發(fā)生遺傳學改變有關(guān)〔4〕。出現(xiàn)2例假陽性，也許并不能完全排除膀胱癌的可能，有報道11例膀胱鏡檢查陰性而FⅠSH檢測陽性患者在3～12個月隨訪中發(fā)現(xiàn)7例膀胱癌〔5〕。說明雖然經(jīng)膀胱鏡檢查陰性的患者，日后其患膀胱癌的風險仍很高，仍需密切隨診。

FⅠSH作為一種新興技術(shù)在膀胱癌的早期診斷和預后評估中可代替膀胱鏡及細胞學檢查，具有無創(chuàng)、敏感性高及特異性強等優(yōu)點，是早期診斷及監(jiān)測膀胱癌較為理想的手段，并對于某些需要使用昂貴治療方案的患者來說，在形態(tài)學檢測的基礎(chǔ)上再行FⅠSH檢測可以更加明確疾病，減少患者因為誤診造成的不必要的費用支出及給患者造成的精神肉體痛苦。但因其探針相對價格較高，目前廣泛應(yīng)用于臨床尚有一定的難度。隨著此項技術(shù)的成熟及試劑成本的降低，相信FⅠSH技術(shù)在膀胱癌的早期診斷中將有著廣泛的應(yīng)用前景。

1 全國腫瘤防治研究辦公室，衛(wèi)生部統(tǒng)計信心中心.中國試點縣、市惡性腫瘤的發(fā)病與死亡〔M〕.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2002:24-34.

2 Cianciulli AM，Leonardo C，Guadagni F，et al.Genetic instability in superficial bladder cancer and adjacent mucosa;an interphase cytogenetic study〔J〕.Hum Pathol，2003;34:214-21.

3 Bas WG，van Rhijin HG，van der Poel，et al.Urine markers for bladder cancer surveillance:a systematic review〔J〕.Eur Urol，2005;47(5):736-48.

4 Jose P，Blanca E，Marta S，et al.Clinical utility of a multiprobe FⅠSH assay in voided urine specimens for the detection of bladder cancer and its recurrences，compared with urinary cytology〔J〕.Eur Urol，2002;42(5):547-52.

5 Halling KC，King W，Sokolova ⅠA，et al.A comparison of cytology and fluorescence in situ hybridization for the detection of urothelial carcinoma〔J〕.JUrol，2000;164(5):1768-75.