譚建莊 劉莎莎,2 孫 哲 張宏福＊ 盧慶萍 薩仁娜 趙 峰 楊曉光

草甘膦是一種高效低毒的除草劑,主要通過抑制植物體內(nèi)芳香族氨基酸合成的關(guān)鍵酶——5-烯醇丙酮酸莽草酸 -3-磷酸合成酶(EPSPS)的合成來發(fā)揮作用。孟山都公司通過基因工程手段向常規(guī)大豆中轉(zhuǎn)入 CP4-EPSPS基因,使大豆能高效表達(dá)出 EPSPS,從而使大豆具備了對(duì)草甘膦的耐受性,即抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆(glyphosate-tolerant soybean)。豆粕是我國畜牧養(yǎng)殖業(yè)最重要的蛋白質(zhì)飼料原料之一,目前我國市場上有 70%以上的豆粕是抗草甘膦轉(zhuǎn)基因豆粕(glyphosate-tolerant soybean meal),其潛在的生物安全性問題備受關(guān)注。前人對(duì)抗草甘膦轉(zhuǎn)基因豆粕的飼用安全性的研究主要集中在對(duì)抗草甘膦轉(zhuǎn)基因豆粕的化學(xué)成分的比較分析[1-2],飼喂含抗草甘膦轉(zhuǎn)基因豆粕的飼糧對(duì)動(dòng)物生長性能、屠宰性能[3-5]和繁殖性能[6]的影響,以及外源 DNA和蛋白質(zhì)在動(dòng)物體內(nèi)的殘留檢測(cè)[7-8]等方面,而對(duì)動(dòng)物免疫功能影響的研究報(bào)道較少。小腸是肉雞的主要消化器官,也是機(jī)體抵御飼料中有害抗原入侵的第一道免疫屏障[9],腸黏膜免疫是機(jī)體免疫的重要組成部分。腸黏膜免疫屏障主要由免疫細(xì)胞、免疫球蛋白和細(xì)胞因子等組成[10]。本試驗(yàn)旨在通過研究飼喂含抗草甘膦轉(zhuǎn)基因豆粕的飼糧對(duì)肉仔雞腸黏膜免疫屏障的影響,從黏膜免疫方面評(píng)價(jià)抗草甘膦轉(zhuǎn)基因豆粕的飼用安全性,為轉(zhuǎn)基因飼料的安全性評(píng)價(jià)提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與動(dòng)物分組

試驗(yàn)選用 1日齡愛拔益加(AA)肉仔雞 360只,公母混養(yǎng),隨機(jī)分為 2組,每組 5個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù) 36只雞。每籠為 1個(gè)重復(fù),各重復(fù)隨機(jī)排布于雞舍的不同位置,分別飼喂含抗草甘膦轉(zhuǎn)基因豆粕和常規(guī)非轉(zhuǎn)基因豆粕的飼糧。采用 3層立體籠養(yǎng),常規(guī)免疫程序進(jìn)行免疫,自由采食飲水,試驗(yàn)期 21 d。

1.2 豆粕與試驗(yàn)飼糧

試驗(yàn)用轉(zhuǎn)基因豆粕品種為孟山都 RR抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆(40-3-2),由秦皇島金海糧油工業(yè)有限公司提供;常規(guī)非轉(zhuǎn)基因豆粕品種為國產(chǎn)大豆,由黑龍江慶豐集團(tuán)克山昆豐油脂有限公司提供。

試驗(yàn)飼糧采用玉米 -豆粕型飼糧,參照 NY/T 33—2004 0～3周齡肉雞營養(yǎng)需要推薦量配制,其組成及營養(yǎng)水平見表 1。

表1 飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the diets(air-dry basis) %

1.3 樣品采集和處理

于試驗(yàn)第 21天從每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取 3只雞屠宰,快速取十二指腸(派依爾節(jié)處)、空腸(卵黃蒂前 1 cm處)和回腸(回盲口前 5 cm處)各 1 cm,立即置于 4%的甲醛溶液中固定,常規(guī)石蠟包埋、連續(xù)切片,切片厚 5μm。

取空腸組織 2 g、空腸食糜(卵黃蒂前 5 cm處)2 g于 Axgen離心管中,液氮速凍,-80℃保存。稱取空腸組織 100 mg于 1 mL細(xì)胞裂解液(北京賽馳生物科技有限公司)中,在玻璃勻漿器冰浴勻漿,4℃ 10 000 r/min離心 5 min,取上清液;稱取 500 mg空腸食糜于 1.5 mL 0.01 mol/L的 PBS(pH=7.2)中,渦旋混勻,10 000 r/min離心 5 min,取上清液。取空腸組織勻漿和食糜上清液,采用碧云天 BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量后,-20℃保存?zhèn)錅y(cè)其他指標(biāo)。

1.4 指標(biāo)測(cè)定方法

蘇木素 -伊紅(HE)染色,400倍光學(xué)顯微鏡下觀察,每張切片選取 5根走向平直、完整的小腸絨毛,統(tǒng)計(jì) 100個(gè)小腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞(intestinal intraepithelial lymphocytes,iIEL)的數(shù)量。

空腸食糜上清液中分泌型免疫球蛋白 A(sIgA)含量的測(cè)定,采用美國 Bethy公司 IgA酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(ELISA)試劑盒(貨號(hào)為:E30-103);組織勻漿上清液中輔助性 T細(xì)胞(T helper cells,Th1、Th2)細(xì)胞因子白細(xì)胞介素 -2(IL-2)和白細(xì)胞介素 -6(IL-6)含量的測(cè)定采用美國 Rapidbio公司的 ELISA試劑盒(貨號(hào)分別為:11R020和11R040)。sIgA含量以 sIgA測(cè)定值與食糜上清液中總蛋白含量的比值(μg/mg)表示;IL-2和 IL-6含量以測(cè)定值與組織勻漿上清液中總蛋白含量的比值(pg/mg)表示。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用 SAS 8.0中 2樣品平均值的 T檢驗(yàn)程序進(jìn)行顯著性分析,數(shù)據(jù)以“平均值 ±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示,P＜0.05表示差異顯著,P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 抗草甘膦轉(zhuǎn)基因豆粕對(duì)肉仔雞 iIEL數(shù)量的影響

由圖 1可以看出,轉(zhuǎn)基因豆粕組肉仔雞小腸絨毛結(jié)構(gòu)正常,iIEL散布于小腸絨毛上皮柱狀細(xì)胞之間,胞漿極少,細(xì)胞核大而圓,染色較深,同常規(guī)豆粕組肉仔雞相比,未見明顯變化。從表 2的數(shù)據(jù)可以看出,轉(zhuǎn)基因豆粕組與常規(guī)豆粕組肉仔雞小腸(十二指腸、空腸和回腸)iIEL數(shù)量均無顯著差異(P＞0.05)。同時(shí)可以看出各處理肉仔雞iIEL數(shù)量從十二指腸、空腸到回腸依次遞減。

表2 小腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量Table 2 Number of intraepithelial lymphocytes in small intestine cell/100 absorb cells

2.2 抗草甘膦轉(zhuǎn)基因豆粕對(duì)肉仔雞空腸食糜中sIgA含量及組織中 Th1/Th2細(xì)胞因子水平的影響

由表 3、表 4可以看出,在試驗(yàn)第 21天,轉(zhuǎn)基因豆粕組與常規(guī)豆粕組肉仔雞空腸食糜中 sIgA含量無顯著差異(P＞0.05);2組肉仔雞空腸組織中Th1細(xì)胞因子 IL-2和 Th2細(xì)胞因子 IL-6的含量及IL-2/IL-6均差異不顯著(P＞0.05)。

表3 抗草甘膦轉(zhuǎn)基因豆粕對(duì)肉仔雞空腸食糜中 sIgA含量的影響Table 3 Effects of glyphosate-tolerant soybean meal on the sIgA content in jejunum chyme of broilersμg/mg

表4 抗草甘膦轉(zhuǎn)基因豆粕對(duì)肉仔雞空腸組織中細(xì)胞因子含量的影響Table 4 Effects of glyphosate-tolerant soybean meal on the contents of cytokines in jejunum tissue of broilers pg/mg

3 討 論

3.1 抗草甘膦轉(zhuǎn)基因豆粕對(duì)肉仔雞 iILE數(shù)量的影響

小腸黏膜內(nèi)淋巴細(xì)胞群是腸黏膜免疫的主要效應(yīng)器官,它主要存在于小腸絨毛上皮和固有層內(nèi)。iIEL以 T淋巴細(xì)胞為主(約占 80%),但也有少量的 K(kill)細(xì)胞和 NK(natural kill)細(xì)胞。它的功能主要是保護(hù)機(jī)體免受腸腔病原體和毒素的侵害及分泌細(xì)胞因子[11-12]。本研究結(jié)果顯示,飼喂含抗草甘膦轉(zhuǎn)基因豆粕的飼糧沒有引起肉仔雞 iIEL數(shù)量的變化,沒有引起肉仔雞 iIEL的異常免疫反應(yīng),未對(duì)肉仔雞 iIEL的免疫功能產(chǎn)生不良影響。且 iIEL數(shù)量呈現(xiàn)出從十二指腸到回腸逐漸降低的趨勢(shì),這與楊倩等[13]、楊玉榮等[14]報(bào)道的正常 iIEL變化結(jié)果一致。

3.2 抗草甘膦轉(zhuǎn)基因豆粕對(duì)肉仔雞空腸食糜中sIgA含量的影響

sIgA是腸黏膜免疫中的主要效應(yīng)因子,它具有阻斷腸道病原微生物和抗原物質(zhì)對(duì)腸黏膜的黏附、中和病毒和毒素、激活補(bǔ)體等作用[15]。當(dāng)腸腔中sIgA分泌不足時(shí),腸黏膜會(huì)因?yàn)槭澄镏械牟≡w或其他大分子抗原的侵害,產(chǎn)生免疫炎癥。腸腔 sIgA分泌量的改變是評(píng)價(jià)腸黏膜免疫功能的一項(xiàng)重要指標(biāo)[16]。本試驗(yàn)研究顯示,轉(zhuǎn)基因豆粕組與常規(guī)豆粕組空腸食糜中 sIgA含量無顯著差異,表明飼喂含抗草甘膦轉(zhuǎn)基因豆粕的飼糧沒有對(duì) sIgA的分泌造成不良影響。

3.3 抗草甘膦轉(zhuǎn)基因豆粕對(duì)肉仔雞空腸組織中Th1/Th2細(xì)胞因子分泌的影響

輔助性 T細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞,根據(jù)其產(chǎn)生細(xì)胞因子的不同可以分為 Th1和 Th2亞群。Th1亞群主要分泌 IL-2、干擾素 -γ(IFN-γ)、干擾素 -α(IFN-α)和腫瘤壞死因子 -β(TNF-β)等,主要參與細(xì)胞免疫;Th2亞群主要分泌 IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和 IL-13等,主要參與體液免疫。在正常生理狀態(tài)下,Th1/Th2處于一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài),Th1/Th2的不平衡可造成疾病的不同病理狀態(tài)。本試驗(yàn)研究結(jié)果顯示,在試驗(yàn)第 21天,常規(guī)豆粕組與轉(zhuǎn)基因豆粕組肉仔雞 IL-2和 IL-6的分泌量差異不顯著,IL-2/IL-6差異不顯著,表明飼喂含抗草甘膦轉(zhuǎn)基因豆粕的飼糧未對(duì)肉仔雞空腸組織中Th1/Th2細(xì)胞因子的分泌及其免疫平衡產(chǎn)生不良影響,同時(shí)也說明飼喂抗草甘膦轉(zhuǎn)基因豆粕沒有引起肉仔雞腸黏膜產(chǎn)生病理性變化。

Finamore等[17]研究顯示斷奶小鼠在連續(xù)飼喂轉(zhuǎn)基因 Bt蛋白玉米(Mon810)30 d后,血清中 Th1細(xì)胞因子 IFN-γ含量雖未出現(xiàn)顯著變化,但是血清中 Th2細(xì)胞因子IL-6和IL-13的含量顯著增加。這表明飼喂轉(zhuǎn)基因玉米引起了斷奶小鼠 Th1/Th2免疫平衡向 Th2方向偏移,與本試驗(yàn)結(jié)果不同,具體是由于試驗(yàn)動(dòng)物的不同、還是由于試驗(yàn)材料的不同而導(dǎo)致還有待進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

飼喂含抗草甘膦轉(zhuǎn)基因豆粕的飼糧在試驗(yàn)期間未引起肉仔雞 iIEL數(shù)量、空腸食糜中 sIgA含量和空腸組織中 Th1/Th2細(xì)胞因子的含量發(fā)生顯著性變化,未對(duì)所檢測(cè)的各項(xiàng)腸黏膜免疫指標(biāo)產(chǎn)生不良影響。

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