周 懌 刁其玉 屠 焰 云 強(qiáng)

胃腸道既是動(dòng)物消化食物,吸收營養(yǎng)的主要場所,也是機(jī)體內(nèi)的第一道防御屏障。定植于動(dòng)物胃腸道中的良好的微生物菌群對腸道的組織形態(tài)、代謝和功能有極大的影響[1],有助于更大程度地發(fā)揮動(dòng)物的生長性能。新生犢牛由于胃腸道消化機(jī)能及免疫屏障功能發(fā)育不健全,極易受病原微生物的侵害而引起腹瀉,導(dǎo)致高發(fā)病率和高死亡率[2]。飼用抗生素(antibiotics)通過非選擇性抑菌或殺菌作用,可消除腸道有害微生物對犢牛生長的抑制作用。但是近年來,鑒于抗生素的大量使用導(dǎo)致了腸道菌群失衡等負(fù)效應(yīng),各國對抗生素的使用管理也越來越嚴(yán)格。因此,益生素(probiotics)的研究和應(yīng)用逐步成為研究熱點(diǎn)之一。研究表明,在 5周齡內(nèi)犢牛的代乳粉中添加抗生素和益生素對于降低犢牛腹瀉和提高生長性能具有相似的效果[3-4]。研究進(jìn)一步證實(shí),益生素可抑制由溶血性大腸桿菌導(dǎo)致的幼齡反芻動(dòng)物腹瀉,進(jìn)而促進(jìn)幼齡反芻動(dòng)物的生長[5]。

酵母 β-葡聚糖不同于植物細(xì)胞壁中的 β-(1→4)葡聚糖,酵母 β-葡聚糖主要來源于酵母細(xì)胞壁,是由 D-葡聚糖通過 β-(1→3)鍵的方式相結(jié)合,并含有高度分支的 β-(1→6)鍵結(jié)合的多聚糖。它在消化道中不可溶,不吸收,同時(shí)不產(chǎn)生黏性。目前,關(guān)于酵母 β-葡聚糖在幼齡反芻動(dòng)物中應(yīng)用的研究報(bào)道較少,特別是關(guān)于它對犢牛腸道微生物區(qū)系影響的報(bào)道就更為少見。本試驗(yàn)擬從早期斷奶犢牛生長性能、腸道主要微生物數(shù)量及胃腸道組織發(fā)育 3方面來比較酵母 β-葡聚糖與抗生素對早期斷奶犢牛腸道發(fā)育的影響,以期為早期斷奶犢牛胃腸道發(fā)育調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

酵母 β-葡聚糖為淡黃色粉末,購自珠海天添生物工程技術(shù)有限公司(批號 20080701),干物質(zhì)含量 95.58%,粗蛋白質(zhì)含量 4.57%,純度為82.75%。桿菌肽鋅為淡褐色粉末,購自天津新星獸藥廠,含量 15%。大腸桿菌購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,菌株號 cvcc 222,血清型 O141∶K99,是引起犢牛腹瀉的主要治病菌。

1.2 飼養(yǎng)管理與試驗(yàn)飼糧

試驗(yàn)在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院南口中試基地進(jìn)行。選取 20頭新生健康荷斯坦公犢牛(購自三元奶牛場),按體重和出生時(shí)間一致原則隨機(jī)分成 4組,每組 5個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù) 1頭牛。犢牛 1～7日齡飼喂鮮乳,飼喂量為犢牛體重的 8%。飼養(yǎng)試驗(yàn)于犢牛 1周齡時(shí)進(jìn)行,全期共 28 d。

試驗(yàn)基礎(chǔ)飼糧包括犢牛代乳粉和開食料 2部分。整個(gè)試驗(yàn)期內(nèi)每天分別于 08:00和 18:00飼喂?fàn)倥４榉埏暭Z[6](用煮沸后冷卻至 40～45℃的熱水與代乳粉干物質(zhì)按 7∶1的重量比沖泡),乳液飼喂量為犢牛體重的 10%。于犢牛第 21日齡起開始訓(xùn)練犢牛采食開食料飼糧,各組犢牛開食料的飼喂采用限飼制度,每頭犢牛每天補(bǔ)飼300 g,自由飲水,記錄每天采食量。每頭犢牛單獨(dú)飼養(yǎng)于 0.9 m×3.5 m的犢牛圍欄,下鋪設(shè)漏縫地板。

試驗(yàn)用代乳粉為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所家畜營養(yǎng)與飼料研究室研發(fā)的產(chǎn)品,開食料組成及營養(yǎng)水平與代乳粉營養(yǎng)水平見表 1和表 2。

表1 開食料組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of starter diet(air-dry basis) %

表2 代乳粉營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 2 Nutrient levels of milk replacer(air-dry basis)%

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì),A組為對照組,B、C、D組為試驗(yàn)組,具體見表 3。在試驗(yàn)第 21天晨飼時(shí),通過將大腸桿菌肉湯培養(yǎng)基(109個(gè)/mL)混入犢牛代乳品中對 A、B、D 3組進(jìn)行口服大腸桿菌攻毒,攻毒劑量約為 30 mL。

表3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)表Table 3 Experimental design table

1.4 樣品采集、測定項(xiàng)目與方法

1.4.1 生長性能

在試驗(yàn)開始第 1、14、21、28天晨飼前 ,稱取每頭犢牛的空腹體重。每日記錄犢牛代乳粉和開食料的耗料量。統(tǒng)計(jì)各階段犢牛的平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和飼料轉(zhuǎn)化率(F/G)。

1.4.2 直腸中主要微生物數(shù)量的測定

于試驗(yàn)第 21天分別采集攻毒后 3、12、24 h犢牛直腸內(nèi)約 10 cm處靠近上壺腹黏膜部的糞便樣品,無菌操作,迅速帶回實(shí)驗(yàn)室,放入帶有玻璃珠的三角瓶中,稱重后以 1∶9(W/W)的比例加入無菌生理鹽水,依次以 10倍梯度稀釋,選擇適宜的稀釋度,分別涂布在乳酸菌選擇性培養(yǎng)基(MRS)、伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基(EMB)(均購于北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司),每個(gè)梯度做 3組重復(fù),于 37℃恒溫培養(yǎng)箱分別培養(yǎng) 72、24 h后計(jì)算菌落數(shù),并以用 1 g腸道內(nèi)容物中細(xì)菌個(gè)數(shù)的對數(shù)[lg(cfu/g)]表示直腸內(nèi)容物中主要微生物數(shù)量[7]。

1.4.3 胃腸道組織形態(tài)學(xué)觀察

試驗(yàn)第 28天晨飼前從各組隨機(jī)選取 3頭犢牛,用 4%戊巴比妥鈉溶液(40 mg/kg BW)將犢牛完全麻醉后,剖開腹腔分別在前背盲囊部分用利剪連續(xù)取下 1 cm2的組織塊,另取十二指腸近端5 cm處、空腸中段和回腸中段約 1 cm的腸管,用生理鹽水沖洗殘余內(nèi)容物后,迅速將樣品浸泡至入 4%多聚甲醛 -0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.4)中固定,4℃固定 48 h后,石蠟包埋做組織切片。瘤胃及腸道固定樣品經(jīng)蘇木精 -伊紅(HE)染色后,在 10×10倍光鏡(Motic BA200)下觀測其形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化,并利用 Motic images advanced 3.2軟件測量瘤胃前背盲囊乳頭高度、乳頭寬度及黏膜厚度,小腸各部位絨毛高度、隱窩深度及黏膜厚度。每個(gè)樣本觀察 2個(gè)非連續(xù)切片,每張切片選取 3個(gè)視野,每個(gè)視野分別測定 10組數(shù)據(jù),其平均值作為 1個(gè)測定數(shù)據(jù)。

1.5 數(shù)據(jù)分析與處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析利用 SAS 8.2軟件包中的平衡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方差分析過程(ANOVA)進(jìn)行,均值的多重比較采用 Duncan氏法進(jìn)行,以 P＜0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果以平均值 ±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。

2 結(jié) 果

2.1 酵母 β-葡聚糖與抗生素對早期斷奶犢牛生長性能的影響

由表 4可見,大腸桿菌攻毒前,即第 1～14天和第 14～21天 2個(gè)階段時(shí),與對照組相比,B組犢牛ADG分別提高了 26.17%和 24.93%(P＜0.05),D組犢牛 ADG分別提高了 30.89%和28.57%(P＜0.05);大腸桿菌攻毒后,即第 22～28天期間,B、D組 ADG分別比對照組提高了30.38%和 30.81%(P＜0.05),但與 C組差異不顯著(P＞0.05)。

對于試驗(yàn)各期 F/G,B、D組均顯著低于對照組,特別是大腸桿菌攻毒后,B、D組 F/G比對照組分別降低了 15.74%和 20.81%(P＜0.05),與 C組差異不顯著(P＞0.05)。同樣的,從試驗(yàn)全期來看,B、D組 F/G比對照組分別降低了 17.53%和19.58%(P＜0.05)。

2.2 酵母 β-葡聚糖與抗生素對早期斷奶犢牛直腸微生物數(shù)量的影響

由表 5可見,大腸桿菌攻毒后 3、12和 24 h,B組犢牛直腸中乳酸桿菌數(shù)量高于對照組,但是差異不顯著(P＞0.05),D組 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)乳酸桿菌數(shù)量均顯著低于 B、C和對照組(P＜0.05);而 B、C組之間犢牛直腸乳酸桿菌數(shù)量無顯著差異(P＞0.05)。C組犢牛直腸中乳酸桿菌數(shù)量顯著高于對照組(P＜0.05)。

與對照組相比,大腸桿菌攻毒后 12 h,B、D組顯著降低了犢牛大腸桿菌攻毒后 12和 24 h時(shí)直腸中大腸桿菌數(shù)量(P＜0.05),分別降低了9.79%、10.09%與 16.35%、15.38%。同時(shí),B組在 12和 24 h時(shí)犢牛直腸大腸桿菌數(shù)量顯著高于C組(P＜0.05)。

表4 酵母β-葡聚糖與抗生素對早期斷奶犢牛生長性能的影響Table 4 Effects ofβ-glucan and antibiotics on growth performance of early-weaned calves

表5 酵母β-葡聚糖與抗生素對早期斷奶犢牛直腸微生物的影響Table 5 Effects ofβ-glucan and antibiotics on microflora in rectum of early-weaned calves lg(cfu/g)

2.3 酵母 β-葡聚糖與抗生素對早期斷奶犢牛胃腸道組織形態(tài)學(xué)的影響

由表 6可見,與對照組相比,B、C組可顯著增加犢牛瘤胃乳頭高度、寬度(P＜0.05)。與對照組相比,各組犢牛十二指腸絨毛高度無顯著差異(P＞0.05),而 C、D組犢牛十二指腸隱窩深度顯著低于對照組和 B組(P＜0.05);B、C和 D組絨毛高度和隱窩深度比(V/C)顯著高于對照組(P＜0.05)。

各組犢?？漳c中段絨毛高度和隱窩深度無顯著差異(P＞0.05),絨毛高度和隱窩深度比(V/C)也以試驗(yàn) B、C組顯著高于對照組(P＜0.05)?；啬c中段各形態(tài)指標(biāo)與空腸中段變化趨勢相同,各組間絨毛高度和隱窩深度無顯著差異(P＞0.05),但 B、C和 D組 V/C顯著高于對照組(P＜0.05)。

表6 酵母β-葡聚糖與桿菌肽鋅對早期斷奶犢牛瘤胃和小腸形態(tài)發(fā)育的影響Table 6 Effects ofβ-glucan and bacitracin zinc on rumen and intestinal morphological development of early-weaned calves μm

3 討 論

3.1 酵母 β-葡聚糖與抗生素對早期斷奶犢牛生長性能的影響

桿菌肽鋅是多肽類抗生素,一方面它可以抑制腸內(nèi)病原性微生物的增殖,促進(jìn)有益微生物的生長,減少發(fā)病率,從而促進(jìn)動(dòng)物生長;另一方面,桿菌肽鋅可使畜禽腸壁變薄,增加腸黏膜的通透性和改變腸內(nèi)代謝環(huán)境,從而促進(jìn)營養(yǎng)的消化吸收。研究表明,在火雞飼糧中添加桿菌肽鋅 20、50和 100 mg/kg,飼料轉(zhuǎn)化率分別提高了 0.4%、1.1%和 1.5%,增重分別提高了 1.6%、2.3%和2.8%[8]。據(jù)報(bào)道,在仔豬飼料中添加桿菌肽鋅50 mg/kg,增重比添加土霉素組提高了 22.4%,飼料轉(zhuǎn)化率提高了 14.5%,并證明桿菌肽鋅與硫酸抗敵素合用,可明顯提高仔豬的增重、飼料報(bào)酬及具有良好的預(yù)防腹瀉效果[9]。

目前,關(guān)于 β-葡聚糖對幼齡動(dòng)物生長性能的影響的報(bào)道較多,β-葡聚糖與其他免疫增強(qiáng)劑(如脂多糖)不同,它對動(dòng)物的食欲、生長沒有不良影響[10],并且在飼料中添加 β-葡聚糖可以促進(jìn)動(dòng)物生長[11]。在 19日齡斷奶仔豬的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),在飼料中添加 0.05%～0.80%的 β-葡聚糖可顯著改善仔豬斷奶第 14天后的生長性能,所有β-葡聚糖添加組仔豬的飼料轉(zhuǎn)化率均顯著高于對照組(P＜0.05)[12]。而另一些研究認(rèn)為 β-葡聚糖提高仔豬的生長速度是由于提高了日采食量,對 ADG和 F/G無顯著影響[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn),大腸桿菌攻毒前,與對照組相比,酵母 β-葡聚糖和桿菌肽鋅均可顯著提高犢牛 ADG;同樣,試驗(yàn)各期 F/G,添加酵母 β-葡聚糖(B組)和桿菌肽鋅(D組)均顯著低于對照組,而試驗(yàn)各期各組犢牛ADFI均無顯著差異。就本試驗(yàn)來看,在正常的飼養(yǎng)模式下,酵母 β-葡聚糖和桿菌肽鋅對于提高犢牛生長性能具有相似的效果。

本試驗(yàn)中大腸桿菌攻毒后,B、D組 ADG顯著高于對照組,但是與未攻毒組(C組)差異不顯著。同樣的,B、D組 F/G顯著低于對照組,但與未攻毒組差異不顯著(P＞0.05)。因此,在本試驗(yàn)攻毒應(yīng)激模式下,酵母 β-葡聚糖和桿菌肽鋅可能會(huì)減輕大腸桿菌對犢牛的損傷,并且與未攻毒組差異不顯著。對于酵母 β-葡聚糖組來說,試驗(yàn)結(jié)果可能是由于在感染前使用 β-葡聚糖可增強(qiáng)機(jī)體的免疫清除作用,將抗原抗體反應(yīng)控制在膜免疫局部,減少了全身免疫的負(fù)擔(dān),并且這種免疫保護(hù)作用是以非炎癥的方式來進(jìn)行的,即對動(dòng)物的生長沒有不良影響。

3.2 酵母 β-葡聚糖與抗生素對早期斷奶犢牛直腸微生物數(shù)量的影響

研究證實(shí),大腸桿菌、沙門氏菌和乳酸桿菌的生理功能與動(dòng)物機(jī)體的生命活動(dòng)息息相關(guān)[15]。本試驗(yàn)在抑制直腸中大腸桿菌增殖上,酵母 β-葡聚糖的抑菌效果略低于桿菌肽鋅。這可能是由于酵母 β-葡聚糖和桿菌肽鋅在抑制大腸桿菌增殖上的方式不同,桿菌肽鋅對革蘭氏陽性細(xì)菌有強(qiáng)烈的抗菌作用,對部分革蘭氏陰性菌、放線菌、螺旋菌體抑制效果也明顯,其機(jī)制主要為抑制細(xì)菌的細(xì)菌壁合成,也能與敏感細(xì)菌的細(xì)胞膜結(jié)合,損傷細(xì)胞膜的完整性,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)重要物質(zhì)外流,從而阻礙腸道內(nèi)細(xì)菌繁殖。而 β-葡聚糖主要是在結(jié)腸微生物的作用下生成短鏈脂肪酸,而短鏈脂肪酸能促進(jìn)腸黏膜的生長。另一方面,β-葡聚糖可通過增加腸道分泌型免疫球蛋白(IgA)的分泌量而減少致病微生物對腸道的黏附,從而減少大腸桿菌增殖[16]。

3.3 酵母 β-葡聚糖與桿菌肽鋅對早期斷奶犢牛胃腸道發(fā)育的影響

眾所周知,瘤胃功能的建立是瘤胃內(nèi)容物經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)生的揮發(fā)性脂肪酸刺激的結(jié)果。Lesmeister等[14]通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析對試驗(yàn)所需犢牛數(shù)量、樣品采集部位、樣品采集數(shù)量等進(jìn)行討論,認(rèn)為在評定瘤胃的指標(biāo)中,瘤胃乳頭的長度是最重要因素,其次是瘤胃乳頭的寬度和黏膜厚度。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,瘤胃乳頭長度、寬度和黏膜厚度隨飼糧中酵母β-葡聚糖含量的增加而增大,其中酵母 β-葡聚糖組顯著高于其余各組,這與前述結(jié)果相一致,其原因可能是 β-葡聚糖增加了總揮發(fā)性脂肪酸的產(chǎn)量,從而刺激瘤胃乳頭發(fā)育有關(guān)。

小腸的正常結(jié)構(gòu)是營養(yǎng)物質(zhì)被充分消化與吸收的基本保證。特別是小腸的絨毛長度、V/C、黏膜厚度及絨毛表面積是衡量小腸消化吸收功能的重要指標(biāo)[17-18]。腸絨毛高度與細(xì)胞數(shù)量呈顯著相關(guān)。絨毛高,則成熟的上皮吸收細(xì)胞多,對腸道營養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力就強(qiáng),隱窩深度反映了細(xì)胞生成率,隱窩基部向絨毛端部遷移、分化,形成具有吸收能力的絨毛細(xì)胞,以補(bǔ)充絨毛上皮的正常脫落,基部的細(xì)胞生成率降低,使隱窩變淺。V/C綜合反映小腸的功能狀況[19]。比值上升,則黏膜改善,消化吸收功能增強(qiáng);比值下降,消化吸收功能降低,動(dòng)物生長發(fā)育受阻。陳代文等[20]研究表明斷奶仔豬飼糧由母乳轉(zhuǎn)變?yōu)榇槠窌r(shí)如果飼養(yǎng)管理不善,極易加劇腸道對飼糧的過敏反應(yīng),仔豬小腸表現(xiàn)為嚴(yán)重絨毛脫落、腸黏膜細(xì)胞增生和隱窩細(xì)胞有絲分裂速度加快,進(jìn)而導(dǎo)致了仔豬腹瀉。而張運(yùn)濤等[7]研究表明酵母多糖對小腸黏膜的具有保護(hù)作用,掃描電鏡觀察表明,對照組小腸絨毛變形、微絨毛脫落,而試驗(yàn)組小腸絨毛和微絨毛生長發(fā)育正常。本試驗(yàn)結(jié)果表明,添加酵母 β-葡聚糖與桿菌肽鋅組犢牛小腸各段 V/C顯著大于對照組,說明酵母 β-葡聚糖對小腸黏膜具有保護(hù)作用,緩解小腸各段由于應(yīng)激對黏膜的損傷作用,進(jìn)而提高犢牛對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收從而提高犢牛生長速度。

4 結(jié) 論

與對照組相比,無論是正常飼養(yǎng)模式還是在口服大腸桿菌肉湯培養(yǎng)基攻毒模式下:

①酵母 β-葡聚糖和桿菌肽鋅均均可有效地提高犢牛日增重和飼料轉(zhuǎn)化率。

②酵母 β-葡聚糖和桿菌肽鋅對大腸桿菌生長均表現(xiàn)出一定的抑制作用。

③酵母 β-葡聚糖和桿菌肽鋅均能促進(jìn)小腸各段腸黏膜形態(tài)發(fā)育。

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