張建智 趙 峰 張宏福 王洪榮

在家禽體外模擬消化技術(shù)的研究中,首先需要闡明腸道的代謝規(guī)律。然而家禽的腸道較細(xì),腹腔狹小,文獻(xiàn)報(bào)道的家禽腸道消化液組成參數(shù)多通過(guò)屠宰取食糜的方法從死禽體內(nèi)獲得,所得信息的可靠性差。因此,如何解決在可大量獲取有代表性腸道食糜后研究小腸各段食糜的特性,對(duì)體外模擬消化過(guò)程的建立非常重要。自 20世紀(jì) 50年代以來(lái),人們?cè)谇萦媚c道套管的研制上進(jìn)行了許多嘗試,Dixon等[1]利用結(jié)腸造口術(shù)測(cè)定了雞飼料消化能,Johns等[2]利用回腸套管測(cè)定了雞回腸氨基酸消化率。然而,這些研究多是采用玻璃管或 1 mL硬質(zhì)塑料注射器作為套管,經(jīng)常出現(xiàn)套管脫落或滑入腹腔,食糜在套管管型部干涸、堵塞及自泌樣品無(wú)法低溫保鮮等一系列問(wèn)題。近年來(lái),本研究組所在的動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分別從禽用套管、套管塞、采樣瓶、荷術(shù)外科手術(shù)等幾個(gè)方面進(jìn)行了系統(tǒng)研究[3],并申報(bào)了禽用腸道套管的國(guó)家專利(專利申請(qǐng)?zhí)?zl201020257424.3;zl201030236703.7)。這為大量獲取家禽腸道消化生理信息的基礎(chǔ)參數(shù)提供了創(chuàng)新手段。通過(guò)該套管技術(shù),本實(shí)驗(yàn)室曾以北京鴨為試驗(yàn)動(dòng)物,系統(tǒng)研究了鴨腸液中主要消化酶活性的晝夜變異規(guī)律及飼糧營(yíng)養(yǎng)水平對(duì)腸液組成的影響[4-5]。然而,在小腸消化特性的研究上,雞和鴨在體重、腸道尺寸上存在著較大的差異,且不同腸段食糜的流量也有各自的特性,該套管技術(shù)是否適合于雞小腸消化生理的研究,通過(guò)腸道套管所獲得的十二指腸、空腸、回腸食糜有哪些特性等問(wèn)題仍有待深入研究。為此,本試驗(yàn)選用在代謝能測(cè)定中常用的成年蛋公雞為試驗(yàn)動(dòng)物,分別在十二指腸、空腸、回腸安裝 T型套管,通過(guò)觀察試驗(yàn)雞術(shù)后的健康狀況及各腸段食糜、食糜干物質(zhì)、腸液、腸液總蛋白流量的日內(nèi)變異和日間變異,探討基于 T型套管瘺術(shù)的雞腸道各段食糜的基本生物學(xué)特性,從而為雞體外模擬消化方法的研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及套管安裝

選擇 18周齡健康、體重基本一致[平均體重為(2.30±0.19)kg]的成年海蘭褐佳蛋公雞114只,隨機(jī)分為 3組,每組 38只。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室禽用 T型套管安裝方法[3],分別在試驗(yàn)雞十二指腸、空腸、回腸安裝套管。其中十二指腸套管安裝在 U形彎曲段的大彎處,空腸套管安裝在卵黃囊憩室附近 2 cm范圍內(nèi),回腸套管安裝在距回盲結(jié)合部約 10 cm處。最終安裝 T型套管荷術(shù)雞 110只,其中十二指腸、空腸、回腸荷術(shù)雞分別為 35、38和 37只。

術(shù)前絕食 24 h,術(shù)后試驗(yàn)雞放于代謝籠單籠飼養(yǎng),禁飼 3 d,自由飲水。每只雞每日護(hù)理 3次:口服青霉素 20萬(wàn)單位、鏈霉素 5萬(wàn)單位,灌服補(bǔ)液(0.9%NaCl、10%葡萄糖各 30 mL),并用碘酊、酒精棉擦拭術(shù)部。集中護(hù)理 3 d,第 4天、第 5天開(kāi)始限飼(15 g/只),以后每日的限飼量在前 1天基礎(chǔ)上增加 15 g,直至術(shù)后 10 d左右恢復(fù)自由采食(110 g/只)。第 10天開(kāi)始拆線并去掉套管墊圈。術(shù)后 15 d荷術(shù)雞自由采食玉米 -豆粕型飼糧(表 1),飼養(yǎng)管理按照動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)程序進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用 3×6完全隨機(jī)設(shè)計(jì),其中采樣日期設(shè) 3個(gè)處理,即術(shù)后第 31天、第 34天、第 37天采樣。日內(nèi)采樣時(shí)間設(shè) 6個(gè)處理,即采樣日內(nèi)的 09:30—10:30、13:30—14:30、 17:30— 18:30、 21:30—22:30、01:30— 02:30、05:30— 06:30,通過(guò)套管收集 1 h腸道食糜樣品。待荷術(shù)雞經(jīng)過(guò) 20 d的恢復(fù)期后,分別從 3組健康荷術(shù)雞(十二指腸荷術(shù)雞 35只,空腸荷術(shù)雞 32只,回腸荷術(shù)雞 33只)中各隨機(jī)選擇 15只,分為 5個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù) 3只雞。根據(jù)兩因素完全隨機(jī)設(shè)計(jì)方案分配到每個(gè)處理中。

表1 飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the diet(air-dry basis) %

1.3 樣品制備及測(cè)定指標(biāo)

每次準(zhǔn)確收集 1 h食糜樣品后,測(cè)定食糜的體積并稱重。同時(shí),取上清液 6～12 mL,分裝于1.5 mL離心管中,于 -20℃保存。剩余食糜轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿,放入烘箱,先 65℃烘 12 h,然后 105℃烘4 h,測(cè)食糜絕干重。

將保存的食糜上清液在 4℃﹑ 1 250×g條件下離心 10 min,離心結(jié)束后于 40℃水浴鍋恒溫加熱 3 min,并吸取 1 mL測(cè)定腸液比重,同時(shí)根據(jù)腸液比重計(jì)算腸液的體積。計(jì)算公式如下:

腸液總重(g/h)=食糜總重(g/h)-食糜干物質(zhì)總重(g/h);

腸液流量(mL/h)=腸液總重(g/h)/腸液比重(g/mL);

腸液總蛋白流量(mg/h)=腸液總蛋白含量(mg/mL)×腸液流量(mL/h);

食糜干物質(zhì)含量(g/mL)=食糜干物質(zhì)流量(g/h)/食糜流量 (mL/h)。

腸液總蛋白含量采用南京建成生物工程研究所提供的考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒(人份:100T;批號(hào):20101015)測(cè)定。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)利用 SAS 9.1[6]軟件 ANOVA模塊對(duì)術(shù)后體重進(jìn)行方差分析。

統(tǒng)計(jì)模型為:Yij=μ+Wi+ξij。

式中,μ為總體平均值,W為體重,ξij為隨機(jī)誤差項(xiàng)。

利用 SAS 9.1[6]軟件的 UNIVARIATE、ANOVA程序分別對(duì)各處理間的數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性與方差齊次性檢驗(yàn)。

采用 3×6完全隨機(jī)模型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,模型為:

式中,μ為總體平均值,D為日期,T為時(shí)間效應(yīng),ξijk為隨機(jī)誤差項(xiàng)。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值 ±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,均值多重比較采用 Duncan氏法進(jìn)行,顯著水平為 P＜0.05。

2 結(jié) 果

2.1 T型腸道套管荷術(shù)雞的健康狀況及術(shù)后體重的恢復(fù)

荷術(shù)雞在 1周內(nèi)恢復(fù)采食,術(shù)部完全愈合。術(shù)后 1周內(nèi)荷術(shù)雞主要表現(xiàn)為體重下降、雞冠暗紅、糞便稀少。而在隨后 1周內(nèi)荷術(shù)雞雞冠鮮紅、羽毛整齊清潔、糞便呈現(xiàn)灰色或灰褐色?；謴?fù)期內(nèi)有少數(shù)試驗(yàn)雞喜好啄食術(shù)部及套管,傷口經(jīng)多次清洗、消毒護(hù)理后 15 d內(nèi)都能恢復(fù)到良好的狀態(tài)(表 2)。除個(gè)別荷術(shù)雞出現(xiàn)套管脫落、眼疾、抓雞應(yīng)激等情況死亡外,其余荷術(shù)雞在術(shù)后 4個(gè)月內(nèi)都健康、正常。術(shù)后 120 d時(shí),十二指腸、空腸、回腸荷術(shù)雞健康的比例分別達(dá)到 80%、76%、81%?？ǚ綑z驗(yàn)表明,腸段不同部位安裝 T型套管,3組荷術(shù)雞間的手術(shù)成功率無(wú)顯著性差異(Х2=0.87,P＞0.05)。從試驗(yàn)雞術(shù)后體重的恢復(fù)情況看,術(shù)后 20 d內(nèi) 3組荷術(shù)雞的體重均呈現(xiàn)先下降然后逐漸恢復(fù)的變化。其中,十二指腸與回腸荷術(shù)雞在術(shù)后 20 d可恢復(fù)到術(shù)前體重,空腸荷術(shù)雞在術(shù)后 25 d也可恢復(fù)到術(shù)前體重。術(shù)后120 d,荷術(shù)雞的體重在術(shù)前體重的基礎(chǔ)上有顯著增加(P＜0.05)。此外,經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析,3組不同部位安裝套管的荷術(shù)雞在術(shù)后 10、20、25、120 d的體重上無(wú)顯著差異(P＞0.05)。

2.2 雞腸道不同位點(diǎn)套管內(nèi)自泌食糜及食糜干物質(zhì)流量的日內(nèi)及日間變異

從雞小腸不同位點(diǎn)(十二指腸、空腸、回腸)套管內(nèi)食糜及食糜干物質(zhì)流量(3 d流量的平均值)的差異看(表 3),十二指腸食糜的流量最大,約為空腸食糜流量的 3.3倍,回腸食糜流量的 4.3倍。十二指腸食糜的干物質(zhì)含量與干物質(zhì)流量也最高,其中干物質(zhì)含量約為空腸食糜的 1.4倍,回腸食糜的 1.6倍;干物質(zhì)流量約為空腸食糜的 5.0倍,回腸食糜的 7.6倍。在不同腸段食糜及干物質(zhì)流量變異幅度的差異上,十二指腸中食糜流量的日內(nèi)和日間變異系數(shù)約為空腸食糜流量相應(yīng)變異系數(shù)的 2.3倍,回腸食糜流量的 1.6～3.3倍。十二指腸食糜干物質(zhì)流量的日內(nèi)和日間變異系數(shù)約為空腸食糜干物質(zhì)流量相應(yīng)變異系數(shù)的 1.9倍,回腸食糜干物質(zhì)流量相應(yīng)變異系數(shù)的 2.4～4.3倍。

從腸道食糜及干物質(zhì)流量的日內(nèi)變異看,十二指腸食糜及干物質(zhì)流量在 3 d的采樣期內(nèi)均呈現(xiàn)隨晝夜交替而逐步下降的變異規(guī)律,09:30—10:30的食糜流量顯著高于其他時(shí)間段食糜流量(P＜0.05),13:30—22:30食糜流量相對(duì)穩(wěn)定,各時(shí)間段之間差異不顯著(P＞0.05),隨后呈現(xiàn)出下降規(guī)律,在 05:30—06:30達(dá)到最低值,顯著低于其他時(shí)間段(P＜0.05);而食糜干物質(zhì)的流量在09:30— 10:30最高 (P＜0.05),在 13:30— 18:30干物質(zhì)流量顯著地降低到一個(gè)較低的平臺(tái)期(P＜0.05),然后在 21:30—次日 06:30再次顯著地降低到一個(gè)更低的平臺(tái)期(P＜0.05)。在空腸食糜及干物質(zhì)流量的日內(nèi)變異上,09:30—14:30食糜流量呈現(xiàn)一個(gè)較高流量的平臺(tái)期,然后逐漸下降并在 21:30—次日 06:30達(dá)到一個(gè)新的較低流量的平臺(tái)期;而食糜干物質(zhì)的流量在01:30—02:30達(dá)到最低值,顯著低于 09:30—14:30食糜干物質(zhì)流量(P＜0.05),而 21:30—次日 06:30食糜干物質(zhì)流量無(wú)顯著性變化(P＞0.05)。在回腸食糜及干物質(zhì)流量的日內(nèi)變異上,09:30—10:30的食糜流量與 01:30—06:30的食糜流量無(wú)顯著差異(P＞0.05),但顯著地低于13:30—18:30的食糜流量(P＜0.05),而 21:30—22:30的流量最低,顯著地低于其他時(shí)間段的食糜流量(P＜0.05);食糜干物質(zhì)流量在 13:30—18:30最高,21:30—次日10:30食糜干物質(zhì)流量無(wú)顯著性變化(P＞0.05)。

表2 術(shù)后荷術(shù)雞的健康狀況Table 2 Health status of cockerels after operation

在腸道食糜及干物質(zhì)流量的日間變異上,十二指腸食糜在 3 d采樣期內(nèi)平均每小時(shí)的流量隨采樣日期延后依次顯著降低(P＜0.05),其食糜干物質(zhì)在第 3天采樣期內(nèi)的平均流量顯著低于前 2天采樣期內(nèi)的平均流量(P＜0.05)。而空腸食糜在第 1天采樣期內(nèi)的平均流量顯著地高于其他 2 d的平均流量(P＜0.05),而后 2天的平均流量無(wú)顯著性差異(P＞0.05),其食糜干物質(zhì)在第 3天和第 1天采樣期內(nèi)的平均流量差異顯著(P＜0.05)?；啬c食糜流量及食糜干物質(zhì)流量 1 d內(nèi)每小時(shí)的平均流量在3 d采樣日期內(nèi)均無(wú)顯著差異(P＞0.05)。

2.3 雞腸道不同位點(diǎn)套管內(nèi)自泌腸液及腸液總蛋白流量的日內(nèi)及日間變異

從雞小腸不同位點(diǎn)套管內(nèi)腸液及腸液總蛋白流量(3 d流量的平均值)的差異看(表4),十二指腸腸液的流量最大,約為空腸腸液流量的 3.3倍,回腸腸液流量的 4.3倍。而空腸腸液總蛋白含量及流量最高,其中,腸液總蛋白含量約為十二指腸腸液總蛋白含量的 3.9倍,回腸腸液總蛋白含量的 1.6倍,流量約為十二指腸腸液總蛋白流量的 1.3倍,回腸腸液總蛋白流量的 2.1倍。在不同腸段小腸腸液及腸液蛋白流量變異幅度的差異上,十二指腸腸液流量的日內(nèi)及日間變異最大,兩者均約為空腸腸液流量的 2.2倍,而日內(nèi)變異約為回腸腸液流量的 1.6倍,日間變異為回腸腸液流量的 2.9倍。從腸液總蛋白流量看,十二指腸和空腸腸液總蛋白流量的日內(nèi)變異相差不大,且都比回腸腸液總蛋白流量的日內(nèi)變異大?？漳c腸液總蛋白流量的日間變異最大,約為十二指腸腸液總蛋白流量的 5.1倍,回腸腸液總蛋白流量的 1.6倍。

?

?

?

從小腸腸液及腸液蛋白流量的日內(nèi)變異看,十二指腸腸液流量在測(cè)定平均值上隨晝夜變化呈現(xiàn)先降后升再降的變異規(guī)律,且 3 d采樣期內(nèi)這種規(guī)律保持一致。但通過(guò)對(duì) 3 d測(cè)值的統(tǒng)計(jì)分析表明,09:30—次日 6:30,十二指腸腸液流量在 09:30—10:30的流量最大,顯著地高于其他時(shí)間的流量(P＜0.05);同時(shí),01:30—02:30十二指腸腸液的流量顯著地高于 05:30—06:30流量的相應(yīng)值(P＜0.05)。十二指腸腸液總蛋白的流量在 09:30—18:30處于較高的平臺(tái)期,在 21:30—次日 06:30處于一個(gè)相對(duì)較低的平臺(tái)期?？漳c腸液流量在09:30—14:30呈現(xiàn)一個(gè)較高的平臺(tái)期,然后逐漸下降,并在 21:30—次日 06:30達(dá)到一個(gè)新的較低的平臺(tái)期;而空腸腸液總蛋白流量在09:30—14:30最高(P＜0.05),然后在 17:30—次日 06:30下降到一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的水平。回腸腸液在 09:30—10:30的流量與 01:30—06:30的流量無(wú)顯著差異 (P＞0.05),顯著地高于 21:30—22:30的流量(P＜0.05),但顯著地低于 13:30—18:30的流量(P＜0.05);而回腸腸液總蛋白的流量卻呈現(xiàn)先下降后回升的變化規(guī)律。

從小腸腸液及腸液蛋白流量的日間變異看,十二指腸腸液在 3 d采樣期內(nèi)平均每小時(shí)的流量隨采樣日期延后依次顯著降低(P＜0.05),而腸液總蛋白的流量在 3 d采樣期間無(wú)顯著差異(P＞0.05)。空腸腸液在第 1天采樣期內(nèi)的平均流量顯著地高于其他 2 d的平均流量(P＜0.05),后2天的平均流量無(wú)顯著性差異(P＞0.05),而腸液總蛋白流量在第1天和第 2天采樣期內(nèi)的平均流量差異不顯著(P＞0.05),但顯著地高于第 3天的平均流量(P＜0.05)?；啬c腸液及腸液總蛋白流量 1 d內(nèi)每小時(shí)的平均流量在 3 d采樣期內(nèi)均無(wú)顯著差異(P＞0.05)。

3 討 論

3.1 腸道套管荷術(shù)雞適宜恢復(fù)期及應(yīng)用時(shí)限的探討

腸道套管安裝過(guò)程需要依次切開(kāi)皮膚層、肌膜、橫斜肌肉層、腹膜及氣囊膜,然后進(jìn)入腹腔,并在背向腸系膜的一側(cè)做套管安裝切口。因此,整個(gè)術(shù)部的創(chuàng)傷較大。從國(guó)內(nèi)外報(bào)道的雞、豬、牛等家畜腸道套管手術(shù)的術(shù)后恢復(fù)期上多規(guī)定為 2～21 d不等(表 5),但鮮見(jiàn)關(guān)于確定恢復(fù)期的依據(jù)。而在應(yīng)用時(shí)限上,也鮮見(jiàn)關(guān)于套管瘺術(shù)雞、豬、牛術(shù)后可利用年限的詳細(xì)數(shù)據(jù)。本試驗(yàn)中,荷術(shù)雞的術(shù)后恢復(fù)及應(yīng)用時(shí)限主要從體況恢復(fù)、術(shù)后淘汰原因、采食量、精神狀態(tài)、羽毛、排泄物狀態(tài)與顏色方面進(jìn)行考察。根據(jù)考察結(jié)果可發(fā)現(xiàn),荷術(shù)雞經(jīng) 20～25 d可恢復(fù)至術(shù)前的健康水平。在荷術(shù)雞的使用時(shí)限上,術(shù)雞經(jīng)過(guò) 4個(gè)月的試驗(yàn)后,體重在術(shù)前的基礎(chǔ)上顯著增加。同時(shí),可保持 80%左右的術(shù)雞在經(jīng)歷了“不同能蛋比飼糧對(duì)腸液組成成分影響的研究”的食糜采集試驗(yàn)后仍保持健康體況。由此可見(jiàn),腸道套管瘺術(shù)在雞小腸消化生理研究上的應(yīng)用時(shí)限在 4個(gè)月以上。

表5 套管瘺術(shù)在畜禽消化生理研究中的應(yīng)用Table 5 Application of cannulation in livestock and poultry

3.2 雞腸道中食糜及腸液流量的特性

成年蛋公雞的小腸全長(zhǎng) 1.2～1.4 m,腸道沿縱向長(zhǎng)度在組織形態(tài)、食糜停留時(shí)間、消化液分泌速度等方面都存在顯著差異。由此導(dǎo)致了腸道不同腸段的食糜及干物質(zhì)流量、腸液及腸液總蛋白流量不僅沿腸道的縱向分布上存在差異,而且在晝夜節(jié)律上也有變異。本試驗(yàn)中,十二指腸的食糜、食糜干物質(zhì)、腸液流量都大大高于空腸和回腸的相應(yīng)流量,這主要是由于沿著小腸縱向長(zhǎng)度,攝入的飼糧逐漸被消化,飲水及內(nèi)源性消化液也逐漸被吸收,從而使得十二指腸、空腸、回腸的食糜、食糜干物質(zhì)及腸液流量依次降低。該結(jié)果與本研究組在前期試驗(yàn)中觀察的結(jié)果[15]一致。在食糜的干物質(zhì)含量上,通過(guò)套管收集到的十二指腸、空腸和回腸的食糜干物質(zhì)含量分別為 6.9%、4.8%、4.3%(表 4),該結(jié)果與張鐵鷹[16]通過(guò)屠宰法獲取的肉仔雞十二指腸、空腸、回腸食糜的干物質(zhì)含量約為 20%相比較有較大的差異,這可能與試驗(yàn)方法及采樣部位有關(guān)。本試驗(yàn)表明,在雞腸道不同位點(diǎn)食糜、食糜干物質(zhì)、腸液及腸液總蛋白流量的日內(nèi)變異及日間變異上,總體呈現(xiàn)白天流量大、夜間流量小的變異規(guī)律,而且在日間的平均流量上也存在差異。該結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)室前期在北京鴨腸液中主要消化酶活性晝夜及日間變異規(guī)律的結(jié)果[5]類似,這種晝夜變異的主要原因可能與自然光照、自由采食條件下雞的日采食量主要分布在白天有關(guān)[17-20]。而在不同采樣日間也存在某些差異,這可能是試驗(yàn)動(dòng)物每天的生理狀態(tài)存在某些差異,從而反映在食糜的特性上也存在日間差異,這一特性與大量消化試驗(yàn)中豬、牛糞樣或腸道食糜樣品常規(guī)養(yǎng)分或指示劑濃度存在日間差異[21]類似。

4 結(jié) 論

①在雞十二指腸、空腸、回腸安裝套管術(shù)后25 d可恢復(fù)到術(shù)前體重,術(shù)后 120 d,試驗(yàn)雞健康正常的比例分別達(dá)到 80%、76%和 81%。

②在自由采食、自然光照條件下,雞十二指腸、空腸、回腸在食糜、食糜干物質(zhì)、腸液及腸液總蛋白流量上呈現(xiàn)白天流量大、夜間流量小的變異規(guī)律,日內(nèi)變異系數(shù)在 6.28%～43.02%。在日間的平均流量上也存在顯著性差異,日間變異系數(shù)在 1.25%～16.40%。

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