許丹丹 黃燕華 曹俊明 藍(lán)漢冰 王國(guó)霞 張榮斌,3 陳曉瑛 嚴(yán) 晶,3

凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)因其具有抗逆能力強(qiáng)、生長(zhǎng)速度快、飼料轉(zhuǎn)化效率和加工出肉率高等諸多優(yōu)點(diǎn),已成為世界三大對(duì)蝦養(yǎng)殖品種之一。近年來(lái),由于養(yǎng)殖環(huán)境惡化,非傳染性疾病和傳染性疾病滋生等一系列問(wèn)題,造成養(yǎng)殖對(duì)蝦機(jī)體氧化損傷嚴(yán)重,免疫力下降,生長(zhǎng)速度降低甚至死亡[1-3]。目前,許多學(xué)者開(kāi)始把注意力轉(zhuǎn)移到對(duì)蝦免疫能力的營(yíng)養(yǎng)調(diào)控方面,并越來(lái)越重視提高蝦類自身的抗病及抗應(yīng)激能力。一般認(rèn)為,甲殼動(dòng)物的免疫主要為非特異性免疫,主要包括血細(xì)胞的吞噬、包掩[4]以及血淋巴中的各種因子或酶等的殺菌、抗菌作用[5-6]。核苷酸是組成細(xì)胞的主要成分,是 DNA和 RNA的基本組成單位,在生物體內(nèi)具有信息編碼、調(diào)節(jié)代謝、傳遞信號(hào)、作為輔酶等重要的生理和生化功能[7]。近年來(lái),對(duì)小鼠[8-9]及人[10-11]的研究表明,機(jī)體許多代謝旺盛的組織(小腸、大腸、淋巴)和細(xì)胞(紅細(xì)胞、白細(xì)胞、骨髓細(xì)胞)從頭合成核苷酸的能力有限,需要補(bǔ)充外源核苷酸。對(duì)哺乳動(dòng)物及畜禽的研究表明,飼料核苷酸可以加快動(dòng)物的生長(zhǎng)速度,提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能[12-13],增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬作用[14-15]以及強(qiáng)化自然殺傷細(xì)胞的活性[16]。Li等[17]和 Devresse[18]分別綜述了核苷酸在魚(yú)類和蝦類的研究現(xiàn)狀,表明外源核苷酸可以促進(jìn)魚(yú)類和蝦類生長(zhǎng),并影響先天免疫系統(tǒng)的激素分泌和細(xì)胞組成,增強(qiáng)免疫因子在應(yīng)激時(shí)快速增長(zhǎng)和快速應(yīng)答的能力。核苷酸自身的堿性氮原子可以捕捉機(jī)體氧化過(guò)程中形成的自由基,具有保護(hù)血細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化物及由過(guò)氧化損傷造成的紅細(xì)胞破裂作用[19]。本研究室前期試驗(yàn)結(jié)果顯示,飼料中添加一定量的鳥(niǎo)苷酸鈉鹽可在一定程度上提高凡納濱對(duì)蝦的增重率、體蛋白質(zhì)及脂肪的含量以及血清和肝胰腺中總抗氧化能力(T-AOC)和超氧化物歧化酶(SOD)活性[20]。飼料中添加一定量的核苷酸粗提物能顯著提高凡納濱對(duì)蝦的增重率,降低飼料系數(shù),提高全蝦粗蛋白質(zhì)和粗脂肪含量[21]。為進(jìn)一步了解核苷酸對(duì)凡納濱對(duì)蝦非特異性免疫及抗氧化能力的作用,本試驗(yàn)擬在飼料中添加不同水平的核苷酸混合物,觀察其對(duì)凡納濱對(duì)蝦幼蝦血清、肝胰腺非特異性免疫及抗氧化相關(guān)指標(biāo)的影響,以便為核苷酸在凡納濱對(duì)蝦飼料中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 核苷酸混合物

5′-胞苷酸、5′-腺苷酸、5′-尿苷酸二鈉、5′-肌苷酸二鈉、5′-鳥(niǎo)苷酸二鈉均由南京同凱兆業(yè)生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供,純度均大于 99%。核苷酸混合物由上述 5種核苷酸按照質(zhì)量比1∶1∶1∶1∶1的比例混勻后制得 。

1.2 試驗(yàn)飼料

以魚(yú)粉、酪蛋白、大豆?jié)饪s蛋白為主要蛋白質(zhì)源,魚(yú)油為主要脂肪源,高筋面粉為主要糖源,配制蛋白質(zhì)和脂肪水平分別為 43.37%和 10.41%的基礎(chǔ)飼料[20-23],其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表 1。在基礎(chǔ)飼料中分別添加 0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 g/kg的核苷酸混合物,配制成 8種試驗(yàn)飼料 ,分別記 為 G0、G0.1、G0.2、G0.4、G0.6、G0.8、G1.0、G1.2。飼料原料粉碎后過(guò) 60目篩,微量成分采取逐級(jí)擴(kuò)大法添加,核苷酸混合物先溶于水,然后混入飼料中。所有原料全部混合均勻后用 SLX-80型雙螺桿擠壓機(jī)制成直徑為1.0 mm的顆粒料,在 55℃下烘干,冷卻后放入密封袋中于 -20℃冰箱中保存待用。

表1 基礎(chǔ)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)管理

凡納濱對(duì)蝦購(gòu)自珠海斗門蝦苗場(chǎng),飼養(yǎng)試驗(yàn)在廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所水產(chǎn)研究中心室內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進(jìn)行。試驗(yàn)水源為經(jīng)沙濾、消毒后的天然海水與自來(lái)水混合后的咸淡水,鹽度為4.5‰～5.5‰,玻璃纖維桶容積為 350 L(直徑80 cm,高 70 cm,水體容積 300 L),進(jìn)水速率為1.4 L/min。試驗(yàn)期間以自然光為光源,光周期為自然光周期,水溫 25～30℃,pH 7.7～8.0,溶氧 ＞5 mg/L,氨氮≤0.02 mg/L,亞硝酸鹽≤0.2 mg/L。試驗(yàn)蝦先在室外循環(huán)水泥池中用蝦苗場(chǎng)的幼蝦飼料將蝦苗培育至 0.43 g左右。試驗(yàn)時(shí)選擇 960尾對(duì)蝦,隨機(jī)分成 8組(每組設(shè) 3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù) 40尾蝦),分別投喂 1種試驗(yàn)飼料,養(yǎng)殖期為 5周。采用飽食投喂法,每天分別在 8:00、15:00和 20:00分 3次投喂,投飼后 30 min吸出殘餌,同時(shí)根據(jù)攝食情況及時(shí)調(diào)整投飼量。每天觀察對(duì)蝦健康狀況,記錄死亡情況。

1.4 樣品采集與測(cè)定

試驗(yàn)結(jié)束時(shí),禁食 24 h,每個(gè)重復(fù)隨機(jī)取 15尾蝦,用 1 mL無(wú)菌注射器插入心臟取血,合并置于無(wú)菌 Eppendorf管中,4℃冰箱靜置過(guò)夜后10 000 r/min離心 10 min,移出血清分裝,于 -20℃冰箱中保存?zhèn)溆?。每個(gè)重復(fù)隨機(jī)取 5尾蝦,分別剝離肝胰腺和肌肉,置于無(wú)菌 Eppendorf管中,于 -80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。分別稱取 0.3 g左右肝胰腺和肌肉,剪碎,放入玻璃勻漿器中,按 1∶9的體積比加入生理鹽水勻漿,制成 10%肝胰腺勻漿液和肌肉勻漿液,在4℃下 3 000 r/min離心 10 min,取上清液,分裝后于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

酶活測(cè)定:血清和肝胰腺中總抗氧化能力(T-AOC),超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)、堿性磷酸酶(AKP)活性和丙二醛(MDA)含量以及肌肉中抗超氧陰離子自由基(O-2?)活性采用南京建成生物工程研究所的試劑盒進(jìn)行測(cè)定,具體測(cè)定方法按照試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行。

血細(xì)胞計(jì)數(shù):每個(gè)重復(fù)隨機(jī)取 5尾蝦,用 1 mL無(wú)菌注射器插入心臟取血,合并置于無(wú)菌 Eppendorf管中。吸取 150μL抗凝劑[參照 Franciso等[24]的方法配制,具體方法如下:NaCl 2.628 0 g、KCl 0.074 5 g、EDTA-Na 0.372 2 g、羥乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)0.238 3 g,蒸餾水定容至 100 mL]于無(wú)菌 Eppendorf管中,注入凡納濱對(duì)蝦血液 100μL,迅速混勻,制備抗凝血。取 50μL抗凝血,加入 10 mL pH為 7.3的 PBS緩沖液進(jìn)行 500倍稀釋,用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(Z2coulter,BECKMAN COULTER)進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

結(jié)果以平均值 ±標(biāo)準(zhǔn)差表示,數(shù)據(jù)采用 SPSS 16.0軟件進(jìn)行處理與分析,先對(duì)數(shù)據(jù)作單因素方差分析(One-way ANOVA),若組間有顯著差異,再進(jìn)行 Duncan氏多重比較,P＜0.05表示差異顯著,P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 對(duì)蝦血細(xì)胞總數(shù)及血清中 T-AOC和 SOD、POD、AKP活性

由表 2可知,凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞總數(shù)隨飼料核苷酸混合物添加量的增加先增加后降低,其中 G0.4和 G0.6組極顯著高于對(duì)照組(P＜0.01),G0.8、G1.0和 G1.2組顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。飼料中添加核苷酸混合物可提高血清 SOD活性,其中G0.6和 G0.8組分別比對(duì)照組提高了 15.27%和16.07%,達(dá)到顯著水平(P＜0.05)。G0.4組血清T-AOC比對(duì)照組提高了 50.98%(P＞0.05),并顯著高于 G1.2組(P＜0.05),其他各組間無(wú)顯著差異(P＞0.05)。血清 POD和 AKP活性隨著核苷酸混合物添加量的增加均呈先升高后降低的趨勢(shì),但各組間差異不顯著(P＞0.05)。

2.2 對(duì)蝦肝胰腺中 T-AOC和 SOD、POD、AKP活性

由表 3可知,各組肝胰腺 SOD活性和 T-AOC先是隨飼料中核苷酸混合物添加量的增加而升高,均在 G0.4組達(dá)到最高值,而后隨著核苷酸混合物添加量的進(jìn)一步增加,二者都呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(P＜0.05),其中 G0～G0.6組 SOD活性顯著高于 G1.0組(P＜0.05),G0.1～G0.6組 T-AOC顯著高于G1.2組(P＜0.05),其他各組間無(wú)顯著差異(P＞0.05)。肝胰腺中 POD和 AKP活性隨著核苷酸混合物添加量的增加均呈先升高后降低的趨勢(shì),但各組間未出現(xiàn)顯著差異(P＞0.05)。

2.3 對(duì)蝦肝胰腺和血清中 MDA含量及肌肉中抗活性

由表 4可知,凡納濱對(duì)蝦肝胰腺中 MDA含量隨著核苷酸混合物添加量的增加而降低,其中G0.2～G1.2組顯著低于對(duì)照組(P＜0.05);各添加組對(duì)蝦血清中 MDA含量與對(duì)照組相比呈現(xiàn)降低的趨勢(shì),但差異不顯著(P＞0.05)。G0.2～G0.6組肌肉中抗 O-2?活性顯著高于 G1.0和 G1.2組(P＜0.05),其他各組間差異不顯著(P＞0.05)。

表2 核苷酸混合物對(duì)凡納濱對(duì)蝦幼蝦血細(xì)胞總數(shù)及血清中T-AOC和 SOD、POD、AKP活性的影響Table 2 Effects of nucleotide mixture on total haemocytes count,serum T-AOC,and activities of SOD,POD and AKP of juvenile Litopenaeus vannamei

表3 核苷酸混合物對(duì)凡納濱對(duì)蝦幼蝦肝胰腺中 T-AOC和 SOD、POD、AKP活性的影響Table 3 Effects of nucleotide mixture on hepatopancreas T-AOC and activities of SOD,POD and AKP of juvenile Litopenaeus vannamei

表4 核苷酸對(duì)凡納濱對(duì)蝦幼蝦肝胰腺和血清中MDA含量及肌肉中抗 O2-?活性的影響Table 4 Effects of nucleotide mixture on hepatopancreas and serum MDA content and muscle anti-O2-?activity of juvenile Litopenaeus vannamei

3 討 論

甲殼動(dòng)物缺乏像高等動(dòng)物那樣的由免疫球蛋白介導(dǎo)的特異性免疫機(jī)能,其免疫主要為非特異性免疫。本試驗(yàn)顯示,飼料中添加核苷酸混合物提高了凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞總數(shù)。血細(xì)胞在非特異性免疫反應(yīng)中起著重要作用,血細(xì)胞總數(shù)的高低在一定程度上能體現(xiàn)機(jī)體抵抗病原體入侵能力的強(qiáng)弱[25]。Burrells等[26]用添加了核苷酸的鮭魚(yú)商品飼料(EWOSVEXTRA Alph,粒徑為 3 mm)飼喂感染鰻弧菌(Vibrio anguillarum)的虹鱒(Oncorhynchus mykiss)、感染傳染性鮭魚(yú)貧血癥病毒(infectious salmon anaemia,ISA)和魚(yú)虱子(Lepeophtheirus salmois)的大西洋鮭魚(yú)(Salmo salar)、感染鮭立克次氏體屬(Piscirickettsia salmonis)微生物的銀大麻哈魚(yú)(Oncorhynchus kisutch),結(jié)果顯示,核苷酸能顯著降低虹鱒、大西洋鮭魚(yú)和銀大麻哈魚(yú)的死亡率;Leonardi等[27]在虹鱒體內(nèi)注射胰腺壞死病毒后飼養(yǎng)60 d,發(fā)現(xiàn)未添加核苷酸組的魚(yú)全部死亡,而添加核苷酸組的魚(yú)全都存活。這可能是由于血淋巴細(xì)胞補(bǔ)救合成嘧啶核苷酸的能力有限,而迅速分化的淋巴細(xì)胞對(duì)嘧啶核苷酸需要量又很大,因此飼料中補(bǔ)充外源核苷酸可以促使血細(xì)胞總數(shù)增加[28],從而提高免疫力。

本試驗(yàn)結(jié)果表明,凡納濱對(duì)蝦幼蝦血清中 SOD活性隨核苷酸混合物添加量的升高而提高,飼料中添加一定量的核苷酸混合物能夠提高血清和肝胰腺中 T-AOC以及肝胰腺中 SOD活性,但核苷酸混合物添加量過(guò)高(1.0和 1.2 g/kg)時(shí),SOD活性和T-AOC有下降趨勢(shì);外源核苷酸對(duì)血清和肝胰腺中的 POD和 AKP活性的影響不顯著。這與在凡納濱對(duì)蝦[29]、鯉魚(yú) (Cyprinus carpio)[30]及異育銀鯽(Carassiusauratus gibelio)[31]中的研究結(jié)果一致。這表明外源核苷酸可以提高凡納濱對(duì)蝦部分免疫因子的活性,但過(guò)度添加核苷酸并不能強(qiáng)化已處于正常狀態(tài)下的免疫系統(tǒng)。外源核苷酸影響機(jī)體非特異性免疫功能的機(jī)理還不是很清楚。本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn),外源核苷酸可以極顯著提高血細(xì)胞總數(shù),而有報(bào)道指出體液因子可在血細(xì)胞中合成并釋放,細(xì)胞反應(yīng)又受體液因子的介導(dǎo)和影響[32],因此,本文作者認(rèn)為,外源性核苷酸可能通過(guò)這二者的協(xié)同作用來(lái)提高對(duì)蝦機(jī)體的免疫力。外源核苷酸提高機(jī)體相關(guān)免疫因子活性的另一個(gè)可能的原因是促進(jìn)免疫相關(guān)基因的表達(dá)。Low等[33]檢測(cè)了以核苷酸飼料飼喂 15周的大菱鲆(Scophthalmus maximus)的非特異免疫相關(guān)基因的表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)脾臟和鰓中免疫球蛋白 M(IgM)和重組激活基因 -1(RAG-1)以及腎臟中白介素 -1β(IL-1β)的基因表達(dá)量顯著高于未添加組。關(guān)于外源性核苷酸對(duì)凡納濱對(duì)蝦非特異性免疫相關(guān)基因表達(dá)等分子生物學(xué)機(jī)制,尚值得深入分析。

MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化典型的代表產(chǎn)物,它可以衡量機(jī)體的抗氧化狀態(tài),又能間接反映出細(xì)胞損傷程度。O-2?是多種自由基的派生源,可以經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)生成其他自由基,不僅其衍生的自由基具有細(xì)胞毒性,O-2?本身也有毒害作用,會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞DNA損壞,破壞機(jī)體功能[34]。O-2?會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生損傷作用,但機(jī)體內(nèi)也存在著對(duì)抗自由基的酶系統(tǒng)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,飼料中添加核苷酸混合物能顯著降低肝胰腺中 MDA含量,一定程度提高肌肉中抗?活性。這表明外源核苷酸有助于清除凡納濱對(duì)蝦組織中的自由基,阻止脂質(zhì)過(guò)氧化作用。各組織中 MDA的降低趨勢(shì)與抗 O-2?、SOD、POD活性和T-AOC的變化趨勢(shì)相反,可能是由于這幾種酶都可以催化?發(fā)生歧化反應(yīng)從而將其消除,防止生物脂質(zhì)過(guò)氧化損傷。王寶杰等[35]研究發(fā)現(xiàn),SOD對(duì)血細(xì)胞吞噬過(guò)程中 O-2?的產(chǎn)生有抑制作用。另外有報(bào)道認(rèn)為,核苷酸本身具有抗氧化的作用,其堿基的氮原子能夠捕獲亞油酸氧化過(guò)程中形成的自由基,并能螯合加速氧化的銅、鐵等離子,減少由脂質(zhì)過(guò)氧化引起的細(xì)胞膜及 DNA的損傷[19]。錢佳等[36]研究發(fā)現(xiàn),鳥(niǎo)苷酸二鈉(GMP?Na2)具有劑量依賴性的體外抗氧化和清除活性氧的能力,10 mmol/L GMP?Na2添加組的羥自由基清除能力高達(dá) 96.64%。關(guān)于外源核苷酸對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物組織中脂質(zhì)過(guò)氧化物含量的影響及核苷酸本身抗氧化作用的研究較少見(jiàn)報(bào)道,有關(guān)問(wèn)題仍有待進(jìn)一步的研究。

本試驗(yàn)以組織脂質(zhì)過(guò)氧化物含量及抗 O-2?活性作為指標(biāo),并結(jié)合 SOD、POD活性和 T-AOC等,探討了外源性核苷酸對(duì)凡納濱對(duì)蝦抗氧化能力的影響,但關(guān)于其進(jìn)一步的作用機(jī)理,尚有待于深入研究。根據(jù)凡納濱對(duì)蝦非特異性免疫相關(guān)指標(biāo)血細(xì)胞總數(shù),血清和肝胰腺中 SOD活性、T-AOC及肌肉中抗 O-2?活性出現(xiàn)最大值的范圍及 MDA含量出現(xiàn)最小值的范圍綜合分析,建議飼料中核苷酸混合物的添加量為 0.4～0.6 g/kg。

4 結(jié) 論

①飼料中添加一定量的核苷酸混合物能顯著提高凡納濱對(duì)蝦幼蝦血細(xì)胞總數(shù)和血清中 SOD活性,對(duì) T-AOC及 POD、AKP活性有提高的趨勢(shì)。

②飼料中添加一定量的核苷酸混合物可一定程度地提高凡納濱對(duì)蝦幼蝦肝胰腺中 SOD、POD和AKP活性及 T-AOC。

③飼料中添加一定量的核苷酸混合物可顯著降低凡納濱對(duì)蝦幼蝦肝胰腺中 MDA含量,提高肌肉中抗 O-2?活性。

④綜合分析以上相關(guān)指標(biāo),建議凡納濱對(duì)蝦幼蝦飼料中核苷酸混合物的添加量為 0.4～0.6 g/kg。

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