孫素真 李海花 馮宗懷

癲癇作為神經(jīng)系統(tǒng)的常見(jiàn)病，引起的認(rèn)知功能障礙嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。癲癇患者認(rèn)知功能障礙是由多因素共同作用的結(jié)果，口服抗癲癇藥物、作為抗癲癇治療的主要手段，其對(duì)認(rèn)知功能的潛在影響更受關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)大鼠海馬區(qū)注射海人酸建立顳葉癲癇模型。通過(guò)Morris水迷宮觀察不同劑量托吡酯對(duì)癲癇大鼠學(xué)習(xí)、記憶的影響及其與劑量的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與分組 健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠48只，均由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重(100±10)g，動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境2 d后，隨機(jī)分為5組:正常對(duì)照組(第1組)8只;海人酸致癇組40只。海人酸致癇組再隨機(jī)分為癲癇對(duì)照組(第2組)、托吡酯20 mg/kg治療組(第3組)、托吡酯40 mg/kg治療組(第4組)、托吡酯80 mg/kg治療組(第5組)，每組10只。托吡酯片由西安楊森制藥公司生產(chǎn)，海人酸購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2 動(dòng)物模型的制作 大鼠適應(yīng)環(huán)境2 d后，予以海馬區(qū)注射海人酸3 μg/kg(溶于0.9%氯化鈉溶液，濃度為4 μg/μl)，第1組以0.9%氯化鈉溶液代替，參照包新民等［1］的大鼠腦立體定位圖譜，立體定向引導(dǎo)于右側(cè)海馬CA3區(qū)?？p合傷口，放回鼠籠，常規(guī)飼養(yǎng)，觀察大鼠行為學(xué)表現(xiàn)。

1.3 灌藥方法 不同灌藥組均把每次劑量藥物稀釋于2 ml蒸餾水中給予灌胃，第1組與第2組分別用2 ml蒸餾水灌胃，用左手拇指和食指固定頭部，中指和無(wú)名指固定另一肢，使動(dòng)物腹部朝上，頭部向上有一個(gè)傾斜度，右手持注射器，使灌胃針頭沿著鼠嘴通過(guò)食管進(jìn)入胃內(nèi);灌注藥物，如很通暢，則說(shuō)明針頭確已進(jìn)入胃內(nèi);如不通暢，大鼠掙扎或發(fā)生咳嗽，則表示針頭沒(méi)有進(jìn)入胃內(nèi)，應(yīng)將針頭拔出重新操作。灌藥劑量均按照人的kg體重20倍計(jì)算。

1.4 Morris水迷宮系統(tǒng)測(cè)定 灌藥6周后開(kāi)始對(duì)大鼠進(jìn)行Morris水迷宮測(cè)試以檢測(cè)其空間學(xué)習(xí)記憶能力。(1)定位航行實(shí)驗(yàn)(place navigation，PN):用于測(cè)量大鼠對(duì)水迷宮學(xué)習(xí)和記憶的獲取能力。訓(xùn)練前1 d讓大鼠自由游泳2 min，開(kāi)始訓(xùn)練后，每天訓(xùn)練4次，每次訓(xùn)練中大鼠分別從不同的入水點(diǎn)入水，將大鼠面向池壁放入水中，觀察并記錄大鼠尋找并爬上平臺(tái)所需時(shí)間(逃避潛伏期，escape latency)如果大鼠在規(guī)定的120 s內(nèi)未找到平臺(tái)，需將其引至平臺(tái)，這時(shí)潛伏期為120 s，取4次逃避潛伏期平均值為每天的逃避潛伏期。(2)空間探索實(shí)驗(yàn)(spatial probe):用于測(cè)量大鼠學(xué)會(huì)尋找平臺(tái)后，對(duì)平臺(tái)空間位置記憶的保持能力。即在第4天的第4次訓(xùn)練結(jié)束后撤除平臺(tái)，24 h后記錄120 s內(nèi)大鼠穿過(guò)平臺(tái)所在位置的次數(shù)。數(shù)據(jù)采集和處理由水迷宮圖像自動(dòng)監(jiān)視處理系統(tǒng)完成。第5組中1只行水迷宮后死亡。

1.5 癲癇大鼠行為學(xué)觀察 發(fā)作程度按Racine分級(jí)標(biāo)準(zhǔn):0級(jí)，無(wú)任何反應(yīng);Ⅰ級(jí):咀嚼、眨眼、立須等面部肌肉抽搐、濕狗樣抖動(dòng)、凝視;Ⅱ級(jí):以點(diǎn)頭運(yùn)動(dòng)為主的頸部肌肉的抽搐、流涎;Ⅲ級(jí):單側(cè)前肢的陣攣、抽搐，搔抓;Ⅳ級(jí):雙側(cè)前肢陣攣，抽搐伴身體直立;Ⅴ級(jí):雙側(cè)后肢強(qiáng)直，身體背曲強(qiáng)直，跌倒伴全身陣攣。獲得連續(xù)5次Ⅱ級(jí)或Ⅲ級(jí)以上發(fā)作者，被認(rèn)為完全點(diǎn)燃［2］。達(dá)到Ⅲ級(jí)改變以上者定為癲癇發(fā)作，連續(xù)的癇性發(fā)作超過(guò)30 min以上者為癲癇持續(xù)狀態(tài)(status epileptics，SE)。

1.6 觀察指標(biāo) (1)5組大鼠每天尋找平臺(tái)的逃避潛伏期; (2)撤除平臺(tái)后穿越平臺(tái)位置的次數(shù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)5組大鼠每天尋找平臺(tái)的逃避潛伏期、撤除平臺(tái)后穿越平臺(tái)位置的次數(shù)進(jìn)行單因素方差分析，單因素方差分析有意義后，進(jìn)行多樣本均數(shù)間比較的Dunnett-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 海人酸誘導(dǎo)癲癇發(fā)作的行為表現(xiàn) 第1組均無(wú)抽搐發(fā)作。注射海人酸4組大鼠均出現(xiàn)Ⅲ級(jí)以上改變即癲癇發(fā)作。

2.2 定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果 在4 d的訓(xùn)練中，第2組每天尋找平臺(tái)的時(shí)間長(zhǎng)于第1組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。托吡酯不同劑量組每天尋找平臺(tái)時(shí)間長(zhǎng)于第2組，并且第4、5組與第2組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，第3組與第2組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表1。

2.3 空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果 第2組尋找平臺(tái)的次數(shù)少于第1組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。托吡酯不同劑量治療組，尋找平臺(tái)的次數(shù)，均明顯少于第2組，并且第4、5組與第2組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，第3組與第2組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表2。

表1 5組大鼠定位航行結(jié)果比較 min，±s

表1 5組大鼠定位航行結(jié)果比較 min，±s

注:與第1組比較，*P＜0.05;與第2組比較，#P＜0.05

組別 第1天 第2天 第3天 第4天第1組(n=8)28.7±8.6 18.5±5.5 11.0±3.0 7.8±1.8第2組(n=10) 45.1±10.9* 30.2±7.1* 23.3±4.9* 12.1±2.7*第3組(n=10) 51.6±11.3 39.0±8.6 28.6±6.6 15.5±3.1第4組(n=10) 61.9±16.7# 52.9±10.3# 40.4±5.6# 22.6±3.7#第5組(n=9) 63.9±15.7# 58.9±10.1# 40.5±5.9# 28.9±4.5#

表2 5組大鼠空間探索結(jié)果比較 次，±s

表2 5組大鼠空間探索結(jié)果比較 次，±s

注:與第1組比較，*P＜0.05;與第2組比較，#P＜0.05

組別 穿越平臺(tái)次數(shù)第1組(n=8)12.8±3.4第2組(n=10) 9.7±2.1*第3組(n=10) 8.2±2.6第4組(n=10) 6.7±1.8#第5組(n=9) 5.4±2.1#

3 討論

海人酸是腦內(nèi)興奮性氨基酸遞質(zhì)-谷氨酸的結(jié)構(gòu)類似物，腦內(nèi)或系統(tǒng)給予驚厥劑量的海人酸，可選擇性的激活邊緣系統(tǒng)，引起急性癲癇發(fā)作。目前，海人酸模型已廣泛用于癲癇發(fā)作的研究，是模擬人類顳葉癲癇的理想模型［3］。

研究表明，癲癇患者確實(shí)存在認(rèn)知功能障礙，且顳葉癲癇患者認(rèn)知功能受損更為明顯［4］。在大鼠海馬注射紅藻氨酸，首先類似于在海馬造成了一個(gè)毀損灶，毀損灶會(huì)導(dǎo)致一定程度的學(xué)習(xí)、記憶障礙，同時(shí)由于長(zhǎng)期癲癇發(fā)作后缺氧等原因，加重了注射側(cè)海馬和對(duì)側(cè)海馬的損傷，從而進(jìn)一步加重學(xué)習(xí)、記憶損害，其模擬的過(guò)程與人類顳葉癲癇所致的學(xué)習(xí)、記憶障礙十分相似［5］。錢若兵等［6］研究顯示:大鼠顳葉CA3區(qū)注射紅藻氨酸后誘發(fā)顳葉癲癇長(zhǎng)期發(fā)作會(huì)出現(xiàn)明顯的學(xué)習(xí)記憶功能障礙。

托吡酯是吡南果糖氨基磺酸酯化合物，是一種單糖，具有多重抗癲癇作用機(jī)制，被證實(shí)對(duì)部分發(fā)作、原發(fā)性全面性發(fā)作、繼發(fā)性全面性發(fā)作的單藥治療和添加治療均有明顯療效［7］。隨著在臨床應(yīng)用時(shí)間的逐漸延長(zhǎng)，其中樞神經(jīng)系統(tǒng)的不良反應(yīng)，尤其是對(duì)癲癇患者認(rèn)知功能的影響，越來(lái)越受到了關(guān)注。吳洵佚等［8］研究顯示托吡酯可以降低癲癇患者的智商，尤其是語(yǔ)言智商。Beata等［9］發(fā)現(xiàn)托吡酯可以影響癲癇患者的運(yùn)動(dòng)功能、注意力、邏輯記憶和視覺(jué)記憶，特別易損害視覺(jué)運(yùn)動(dòng)技巧。Lee等［10］報(bào)告托吡酯對(duì)詞語(yǔ)流暢、注意力、處理信息的速度和工作記憶等認(rèn)知功能造成損害，并認(rèn)為托吡酯對(duì)認(rèn)知功能的損害隨起始劑量、加量速度、合并用藥的增加而增加 。殷其改等［11］研究顯示托吡酯可明顯減少癲癇大鼠的發(fā)作次數(shù)與程度，但同時(shí)大鼠的學(xué)習(xí)記憶力有所下降。研究發(fā)現(xiàn)，托吡酯治療與出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙之間有一定的劑量效應(yīng)關(guān)系，表現(xiàn)為高劑量的托吡酯明顯抑制癲癇大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力，而中低劑量對(duì)學(xué)習(xí)記憶功能的影響不顯著［12］。Martin等［13］研究顯示托吡酯能使健康志愿者出現(xiàn)廣泛智力減慢、心理運(yùn)動(dòng)速度降低、注意力障礙，并且這些影響與劑量相關(guān)。王海燕等［14］研究結(jié)果顯示托吡酯可引起正常大鼠認(rèn)知功能障礙，并且托吡酯大劑量對(duì)照組(0.036 g/kg)學(xué)習(xí)記憶能力損害較托吡酯一般劑量對(duì)照組(0.018 g/kg)更明顯，說(shuō)明托吡酯對(duì)學(xué)習(xí)記憶能力損害可能與劑量相關(guān)。本研究顯示低劑量(20 mg/kg)的托吡酯對(duì)大鼠認(rèn)知功能影響不顯著，中高劑量(40 mg/kg、80 mg/kg)的托吡酯降低了大鼠認(rèn)知功能。

1 包新民，舒斯云主編.大鼠腦立體定位圖譜.第1版.北京:人民衛(wèi)生出版社，1991.97-103.

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