孫秀紅 韋相才 苗竹林 鐘興明 崔 蓉 王小蘭 黃密瓊

1.暨南大學附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科(廣州,510632);2.廣東省計劃生育科學技術(shù)研究所

多囊卵巢綜合征(PCOS)是育齡期婦女常見的生殖內(nèi)分泌疾病,以持續(xù)性排卵障礙、高雄激素血癥、卵巢多囊化為特征,常于青春期開始發(fā)病,在育齡婦女中發(fā)病率約為 6%～10%[1]。臨床癥候具有高度異質(zhì)性,不同患者的病理生理特征差異較大,發(fā)病機制不清,患者主要以藥物治療為主,臨床標本獲取較困難,故對其發(fā)病機制及治療機制的人體研究存在諸多局限,尋找理想的接近人類 PCOS病理特征的動物模型對深入研究 PCOS的發(fā)生發(fā)展及治療有深遠意義。本研究對孕激素聯(lián)合人絨毛膜促性腺激素(hCG)法以及脫氫表雄酮(DHEA)法 2種方法構(gòu)建的 PCOS大鼠模型進行實驗研究,以期為后續(xù)研究提供適宜的動物模型。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 SPF級 21日齡 Sprague-Daw ley(SD)雌性大鼠 120只(購于廣東省醫(yī)學實驗動物中心 ),體重 45 ～55g。

1.1.2 主要試劑 DHEA粉劑(施瑞科技);左旋18-甲基炔諾酮硅膠棒(上海達華制藥);注射用hCG(麗珠制藥);大鼠胰島素檢測酶免(ELISA)試劑盒(廣州達瑞抗體工程技術(shù)有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組和建模 120只 SD大鼠按隨機數(shù)字表分為 4組：模型組 I、II各 44只,對照組 Ⅰ、Ⅱ各 16只。模型組Ⅰ大鼠于 24日齡 5%利多卡因局麻后,股部內(nèi)側(cè)皮埋避孕棒,每只 3～4mm。對照組Ⅰ不予處理;于 27日齡時,模型組Ⅰ大鼠開始頸背部皮下注射 hCG 1.5×103U/L和 0.2ml生理鹽水,對照組Ⅰ大鼠皮下注射生理鹽水 0.2m l;連續(xù)用 9d后停藥。模型組Ⅱ大鼠于 24日齡時開始,每天頸背部皮下注射 DHEA 3mg/100g和 0.2m l注射用油劑,對照組Ⅱ大鼠皮下注射注射用油劑 0.2ml;連續(xù)注射 20d后停藥。停藥后,連續(xù)陰道涂片 7d,觀察陰道上皮周期性變化,初步判斷建模是否成功。

1.2.2 觀察指標 ①從大鼠陰道口開放日齡起,每日 8：00及 20：00觀察并記錄大鼠陰道口開放情況;②動情周期變化,陰道涂片并濕片觀察陰道脫落細胞形態(tài)變化;③相關(guān)指標檢測：模型組Ⅰ大鼠在 42日齡、模型組Ⅱ大鼠在 51日齡、對照組大鼠在陰道涂片示動情間期時,晚 8：00禁食,次日晨 8：00稱重。腹腔注入 10%水合氯醛麻醉,腹主動脈取血 5～8ml。靜置 0.5h后將全血 3 000rpm/min離心10min得血清。血糖儀測定空腹血糖值(FPG);大鼠胰島素 ELISA試劑盒測定空腹血清胰島素水平(FINS);血清雌二醇(E2)、睪酮 (T)、孕酮(P)采用微粒子酶免分析法測定。按照公式計算穩(wěn)態(tài)模型評估(HOMA)指數(shù) =FINS(mμ/L)×FPG(mmol)/22.5[2];④卵巢形態(tài)學觀察,在采血同時各組另取大鼠解剖雙側(cè)卵巢,盡量分離去除卵巢周圍脂肪組織,濾紙包裹后迅速置于電子天平稱其濕重,計算卵巢指數(shù)[3](OC,表示卵巢組織的單位重量);甲醛固定稱量后的卵巢,石蠟包埋切片,HE染色。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 陰道口開放日齡

模型組Ⅰ為 31±3d,對照組Ⅰ為 36±2d;模型組Ⅱ為 27±2d,對照組Ⅱ為 35±2d。模型組大鼠陰道口開放日齡均早于對照組(t=2.534,P＜0.001)。

2.2 動情周期變化

模型組Ⅰ中 38只大鼠、模型組Ⅱ中 34只大鼠連續(xù)陰道涂片觀察顯示持續(xù)處于動情間期,提示無排卵。兩對照組顯示有規(guī)律的動情周期,兩模型組失去規(guī)律動情周期的大鼠的比例分別為 86.4%和77.3%(P＜0.05),模型組Ⅰ建模成功率高于組Ⅱ,有統(tǒng)計學差異。

2.3 大鼠體重和卵巢濕重

模型組 I體重、卵巢濕重、卵巢指數(shù)等均高于對照組(P＜0.05);而模型組Ⅱ體重較對照組明顯減輕,但解剖發(fā)現(xiàn)其卵巢重量及卵巢指數(shù)均高于對照組(P＜0.05),見表 1。

表1 兩種建模方法大鼠體重及卵巢情況比較(±s)

表1 兩種建模方法大鼠體重及卵巢情況比較(±s)

＊與相應(yīng)的對照組比較 P＜0.05

組別 n 實驗前體重(g) 實驗后體重(g) 卵巢濕重(mg) OC值(×10-3)模型組Ⅰ 38 52.56±7.84 177.33±14.32 122.48±12.39 0.70±0.00＊對照組Ⅰ 15 55.37±4.74 168.48±6.69 101.33±5.77 0.61±0.13模型組Ⅱ 34 50.59±5.01 205.65±10.60 137.84±9.24 0.67±0.14＊對照組Ⅱ 15 49.92±4.44 214.90±16.66 126.01±3.53 0.60±0.18

2.4 血清性激素及胰島素抵抗的比較

模型組 I血清 P、T水平較對照組升高(P＜0.05),但 E2水平與對照組相差不大。模型組 II血清 E2、P、T水平均較對照組高(P＜0.05)。兩種建模方法顯示 FPG、FINS及 HOMA指數(shù)均高于相應(yīng)對照組,兩模型組行兩樣本 t檢驗,血清 E2、P水平有統(tǒng)計學差異(P＜0.05),余指標無明顯差異,見表 2。

2.5 卵巢形態(tài)學觀察

2.5.1 大體形態(tài) 對照組卵巢色澤紅潤,卵巢表面多個黃體;模型組卵巢表面蒼白,體積增大,卵巢表面多個擴張的透明囊泡。

2.5.2組織形態(tài) 模型組Ⅰ(圖 1)光鏡下見多個擴張的囊泡,閉鎖卵泡常見,囊泡內(nèi)卵母細胞或放射冠消失,顆粒細胞層數(shù)減少(2～3層),排列疏松,極少見黃體形成;模型組Ⅱ(圖 2)中見多個擴張的囊泡,顆粒細胞疏松,可見黃體組織;對照組(圖 3、4)大鼠卵母細胞清晰,顆粒細胞層數(shù)多(6～10層),排列緊密,有黃體形成。

表 2 兩種建模方法大鼠血清性激素水平及胰島素抵抗的比較(±s)

表 2 兩種建模方法大鼠血清性激素水平及胰島素抵抗的比較(±s)

＊與相應(yīng)的對照組比較 P＜0.05

項目 模型組Ⅰ(n=38)對照組Ⅰ(n=15) 模型組Ⅱ(n=34)對照組Ⅱ(n=15)E2(pg/m l) 8.79±5.83 7.58±5.83 43.43±9.74＊ 31.63±9.35 P(ng/m l) 36.98±4.38＊ 32.14±5.41 29.71±6.34＊ 37.07±4.82 T(ng/dl) 1.21±0.24＊ 0.75±0.06 1.16±0.13 0.80±0.14 FPG(mmol/L) 5.76±0.37＊ 4.74±0.23 5.24±0.34＊ 4.14±0.46 FINS(μU/m l) 18.12±4.47＊ 13.48±2.27 21.73±3.30＊ 15.25±3.92 HOMA-IR 4.00±1.24＊ 2.67±0.33 4.26±1.01＊ 2.84±0.77

3 討論

因大鼠有較穩(wěn)定的動情周期,利用其開展實驗研究經(jīng)濟方便,一直是 PCOS建模的首選。PCOS動物模型的建模方法眾多,如雄激素建模法、雌激素建模法、孕激素聯(lián)合 hCG建模法、胰島素聯(lián)合 hCG建模法、芳香化酶抑制劑建模法及近年來雄激素聯(lián)合hCG建模法[4,5]等。本實驗從中選取了目前較為公認的兩種方法進行了驗證和比較。

目前普遍認為下丘腦 -垂體 -卵巢(HPO)軸功能紊亂導致的促性腺激素(Gn)分泌異常,主要是黃體生成激素(LH)分泌增加,是 PCOS發(fā)病的中間環(huán)節(jié)。LH與高雄激素血癥、胰島素抵抗等典型 PCOS的病理生理變化均密切相關(guān)。早在 1989年Bogovich K就提出孕激素聯(lián)合hCG建模法。其機制是皮下埋植緩釋孕激素避孕劑左旋 18-甲基炔諾酮抑制 HPO軸,使性激素分泌呈低水平,導致不排卵。而 hCG發(fā)揮類 LH的作用,在卵泡早期使用致卵泡閉鎖,故孕激素聯(lián)合使用 hCG可構(gòu)建 PCOS動物模型。

大量臨床研究發(fā)現(xiàn),PCOS多起病于女性的圍初潮期[6]。青春發(fā)育前 2年,腎上腺重量及腎上腺皮質(zhì)厚度增加,腎上腺雄激素合成分泌增多,臨床上表現(xiàn)為血清 DHEA和硫酸脫氫表雄酮(DHEAS)水平顯著升高,促進了伴有腎上腺源性雄激素升高的PCOS的發(fā)生[7]。在此理論基礎(chǔ)上,1991年 Lee等首先用 DHEA成功構(gòu)建了類 PCOS模型,機理為：DHEA是孕烯醇酮經(jīng)△5途徑轉(zhuǎn)化為雄烯二酮的中間產(chǎn)物,該途徑受 LH的調(diào)節(jié)。通過外源性途徑提高 DHEA水平造成雄烯二酮水平增高,進而睪酮及雌酮水平升高,造成 PCOS高雄激素血癥,升高的雌酮水平對 FSH負反饋使促卵泡素(FSH)相對不足,卵泡發(fā)育停滯,從而導致排卵障礙及卵巢多囊改變。

有學者提出 PCOS“青春期發(fā)育亢進學說”[8],假性性早熟已被確定為兒童日后發(fā)展成 PCOS的危險因素之一[9]。故以剛離乳 SD大鼠作為研究對象的建模方法更符合臨床實際而受到研究者的推崇,本實驗也選取剛離乳的幼齡 SD大鼠開始建模。研究結(jié)果顯示,兩種方法建立的 PCOS模型與對照組相比,在青春期表現(xiàn)出早熟、高雄激素、胰島素抵抗及卵泡大量閉鎖卵巢多囊性改變等,基本具備了臨床 PCOS患者基本的病理生理學特征。

本研究顯示,孕激素聯(lián)合 hCG建模法采用皮下埋植孕激素避孕棒緩慢而穩(wěn)定地釋放孕激素,用生理鹽水溶解 hCG皮下注射,方法簡便易于操作,建模周期較短。DHEA因其不溶于水配制成油劑,注射后短期內(nèi)很難完全吸收,吸收率的差異會影響大鼠建模成功率的高低,國內(nèi)外實驗各種指標存在較大差異[10]。本實驗在實際操作中出現(xiàn) DHEA粉劑不易溶解,注射油劑時較困難,注射部位局部皮膚出現(xiàn)硬結(jié)影響藥物吸收等問題,較難操作,且相比孕激素聯(lián)合 hCG建模所需時間長。孕激素聯(lián)合 hCG建模組大鼠表現(xiàn)為明顯的肥胖,血清 E2呈低水平,而DHEA建模組未出現(xiàn)明顯的肥胖,相反還出現(xiàn)了體重較對照組減輕,E2水平也高于對照組,與臨床 P-COS表現(xiàn)不同。這些結(jié)果說明,避孕硅膠棒聯(lián)合 hCG建模組大鼠的形態(tài)學和內(nèi)分泌學改變都與 PCOS患者極為相似,是較為理想的 PCOS動物模型。本研究結(jié)果與桂文武等[11]、朱亮等[12]、夏燕等[10]的結(jié)果較吻合。結(jié)合實際應(yīng)用,由于所用避孕棒長期而持續(xù)地釋放孕激素抑制 HPO軸,一方面模型的持續(xù)時間長,可用于做藥物療效的長期觀察模型;另一方面可能影響促排卵藥物治療療效的觀察研究。而 DHEA建模法可能適合促排卵藥物療效的觀察研究,停用DHEA后恢復排卵的周期尚需進一步探討。

綜上,鑒于 PCOS病理生理及臨床癥候的高度異質(zhì)性決定了 PCOS動物模型的多樣,動物模型適合與否取決于所要研究的 PCOS相關(guān)疾病[13]。本研究顯示兩種方法均獲得理想的效果,證明其在疾病動物模型研究中的應(yīng)用價值。

1 Reckelhoff JF.Polycystic ovary syndrome：Androgens and Hypertension[J].Hypertension,2007,49(6)：1220-1221.

2 Bahceci M,Tuzcu A,Canoruc N.,et al.Serum C-reactive protein(CRP)Levels and Insulin Resistance in Non-Obese Women with Polycystic Ovarian Syndrome,and Effect of Bicalutamide on Hirsutism,CRP Levels and Insulin Resistance[J].Hormone research,2004,62(6)：283～ 287.

3 胡顏霞,張展.來曲唑誘導多囊卵巢綜合征大鼠模型的研究[J].中國婦幼保健.2006,21(7)：957～959.

4 曾蕾,趙紅艷,羅頌平.改良 PCOS-IR大鼠模型的設(shè)計與實驗[J].中華中醫(yī)藥雜志,2010,25(12)：2341～2345.

5 楊正望,周芳.不同造模方法對大鼠多囊卵巢綜合征模型的影響[J].中國實驗動物學報,2010,18(1)：13～16.

6 Kent SC,Legro RS.Polycystic ovary syndrome in asolesecents[J].Ado-lescMed,2002,13(1)：73～88.

7 蔣優(yōu)君,梁黎.血清脫氫表雄酮水平與女性性早熟關(guān)系的探討[J].浙江大學學報(醫(yī)學版),2005,34(4)：308～312.

8 曹澤毅.中華婦產(chǎn)科學[M].北京：人民衛(wèi)生出版社,1999：2176～2216.

9 Rosenfield RL.Identifying children at risk for polycystic ovary syndrome[J].JClin Endocrinol Metab,2007,92(3)：787～ 796.

10 夏燕,王惠仔.多囊卵巢綜合征大鼠模型誘導的實驗研究[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志,2010,18(7)：124～125.

11 桂文武,陳靜.類多囊卵巢綜合征大鼠模型的比較研究[J].中國比較醫(yī)學雜志,2006,16(6)：330～332.

12 朱亮,全松.兩種 SD大鼠多囊卵巢綜合征模型的比較研究[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志,2009,17(3)：81～85.

13 Szukiewicz D,Vilenbroek JT.Polycystic ovary syndrome searching for an animalmodel[J].JMed,1998,29(5-6)：259.